用Lagendorff装置，衡流泵灌流，酶解法分离豚鼠心肌细胞，但每次分离的细胞状态相差很大，请教各位战友，如何判断酶消化的终点？活得状态良好的细胞，用于膜片钳实验，谢谢！




首先你从开胸取出心脏到挂到Lagendorff装置上的时间要短，另外为了防止凝血，给豚鼠腹腔注射点肝素。再有就是你消化时间的控制，我做的时候用的胶原酶II 浓度0.3g/L大概8-10min，当然时间也取决于你灌流的速度，我的速度大概9ml/min。你可以根据灌流液的性状，推断消化的状态，开始时灌流液粘度小，随着时间延长，灌流液越来越稠，后来会拉丝，一般这个时间就可以了，如果消化过了，细胞状态肯定不好。另外影响细胞状态的其他因素，如你配的台氏液和KB液的离子浓度，PH值，所用水的质量等。急性分离的文献很多，你可以再查查，具体操作时仔细一点，多练习下，肯定会好的。




是不是天气温度对酶解时间也有较大的影响？




你灌流时用的恒温水浴，所以不管外界温度什么样，灌流液及离体心脏都是37度，我觉得外界温度的影响不大。





我刚分出来时细胞存活率挺高的，可是放了一小时左右就没剩几个活的了，而且细胞贴壁不好，请问是什么原因




我刚分出来时细胞存活率挺高的，可是放了一小时左右就没剩几个活的了，而且细胞贴壁不好，请问是什么原因？我也遇到同样的问题，KB液重新配过也这样，希望高手回答，不胜感激！




请问分出来后放的是什么液体呢？pH值如何？有没有梯度复钙，一般未复钙前，细胞不太容易死掉，除非细胞损伤太厉害，消过了，或者保存液体的KB液有问题，另外，夏天温度高，细菌也要注意，以前夏天做膜片钳放在浴槽的心肌细胞十分钟不到就有细菌繁殖了？不知道可否能帮助你




我想问下你的酶哪个公司的活性多少，你怎么控制加德量的，谢谢




请问这个问题你现在解决了吗谢谢 我能留下你联系方式吗 我也是做这方面的，可以以后交流吗 谢谢




我把KB液过滤了，有所改善！急性分离的影响因素太多了，不是每次都能分得很好，我们这里做膜片钳的人很少，我也希望能与做这方面的人多多交流，我的联系方式Q261772759