首过效应研究方法
研究某种药物的首过效应一般都是根据药物的实际情况来设计试验。目前基本的方法有器官灌流法，建立药物动力学模型法，结合生理模型法等。
器官灌流法
由于器官灌流既能保持完整的细胞结构，获得全面的生物转化资料，又能消除整体动物实验中的某些不利因素以突出所研究器官对代谢的贡献。所以，长期以来应用于器官功能、生理反应、生化物质、能量代谢、膜屏障和转运机制等方面的研究。随着器官灌流技术的不断完善，逐渐应用于药物代谢方面的研究。在这方面肝脏灌流应用较广泛。肝脏有着丰富的酶系，它对药物可起Ⅰ相和Ⅱ相代谢反应[14]。因此肝脏灌流常用于研究药物代谢反应类型。药物经肝脏灌流发生的Ⅰ相代谢反应有饱和烃的羟化、芳烃羟化、O,N-脱烃基 、N-氧化、酰胺N-羟化、环氧化及其水化以及硝基还原；Ⅱ相代谢反应有葡糖醛酸、硫酸化、N-乙酰化以及谷胱甘肽结合。通过某些检测手段对灌流液中的代谢产物进行定性和定量，就可以了解受试化学物质在肝脏内所发生的代谢变化及反应类型。
肝脏灌流法的类型[15,16]
在各种体外方法中，肝脏灌流在实验条件上与体内方法最接近，是一种与整体肝脏最具可比性的体外模型，因此被广泛应用与药物研究。肝脏灌流按位置可分为离体及原位肝脏灌流；按灌流方式可分为循环式与一过式、正向、反向与双重灌流等。
离体肝灌流与原位肝灌流是最常用的两种灌流技术。前者完成插管手术后肝脏被摘离躯体置于特定的体外装置进行灌流，而后者则在动物躯体内、肝脏原位上进行插管手术及灌流。Mischinger[17]对离体肝灌流技术作了改进，其装置可同时进行两个离体大鼠肝脏灌流。离体灌流与原位灌流的比较显示，两者在中间代谢研究上具有等效性。原位灌流与离体灌流各有优缺点。原位灌流与体内情况的可比性较离体灌流高，其对代谢研究的范围已限于肝脏，但无法避免受肝门静脉和动脉血流、神经和激素等内源性物质对肝脏代谢的影响；离体肝灌流则不受上述因素的影响，而且采样方便，故被广泛应用于药物研究。
循环式肝灌流与一过式肝灌流是按照是否循环来分的。循环式灌流是密闭型灌流，使灌流液流回贮液池，不断循环；一过式灌流是开放性的，灌流液经过肝脏后不再循环，自下腔静脉流出。循环式肝灌流由于灌流液不断循环，因而所需的灌流液量少，但是积累的内源性代谢物有时会影响肝脏的功能。如果灌流液中含血细胞，灌流液的循环亦增加了溶血的情况。一过式肝灌流可以立即检测流出液中化学物的瞬时转变和代谢物生成，减少代谢物积累；可根据流出液中化学物质的变化评价灌流肝脏的活性、观察剂量－反应关系；且易于改变受试物浓度等实验条件。但一过式肝灌流需要大量的灌流液；而且内源性物质不断被灌流液冲洗掉，如果某些代谢过于微弱，就不易检测出其变化。肝萃取率高、代谢较快的药物宜用一过式肝灌流或增加循环式灌流中灌流液内药物的浓度，而肝萃取率低的药物宜进行循环式灌流。
正向灌流与反向灌流 根据灌流液流向不同灌流方法又有正向和反向之分。绝大多数肝脏灌流采用正向设计,即灌流液经门静脉导入,由肝静脉导出。而反向灌流由肝静脉导入,由门静脉或肝动脉导出。Pang 等[18]使用两个三通管可将正向灌流模型转换为反向灌流,并用于探测肝脏药物代谢酶的分布。尽管认为长时间(3 h) 反向灌流会损害肝脏功能, 但Pang 等通过对钾离子、SGOT、SGPT、LDH 的监测及电镜观察,发现短时间(50 min) 反向灌流对肝功能并无损害。
双重灌流 肝脏有两条供血途径：门经脉和肝动脉。通常的离体肝灌流大多只经门静脉灌流而忽略了肝动脉的作用。双重灌流既进行门经脉灌流亦进行肝动脉灌流，可更好地模拟肝脏生理体系。但由于肝动脉太细且离门经脉太近，肝动脉不能直接插管；通常是从腹腔动脉或大动脉或胃十二指肠动脉间接插管，实验操作难度较大。
器官灌流法在首过效应研究中的应用
在药物首过效应的研究中一过式灌流和循环式灌流应用广泛。阮金秀等参照Pang[20]的方法做过T2毒素在灌流大鼠肠肝中的首过效应和代谢动力学的试验，大鼠用25％乌拉坦麻醉。仰卧位固定，腹部作U字形切口，0.5×2mm的塑管从右肾动脉插管，管尖穿过腹主动脉进入上肠系膜动脉作为灌流的入口，插管固定后立即开通灌流，随即打开胸腔，右心房上作一切口。用塑管插入右心房，其尖端顺下腔静脉进入肝经脉作为灌流液出口。分别采用一过式和循环式灌流进行采样检测。一过式灌流测得T2毒素在门静脉流出液中的主要产物为HT2。T2毒素的稳态肝，肠抽提率分别为0.978和0.454，T2在标本中的总有效清除率为7.91ml. min-1接近灌流速度，表明它在通过标本的同时即可被转化。可知T2有明显的肝肠首过效应。循环式灌流测得T2毒素的主要产物HT2，3’-OHHT-2和TEOL分别在30和90分钟达到高峰。本试验的优点在于可以给标本应用体内实验不能承受的剂量，容易通过控制或改变实验条件来观察受试物在肠肝中的整个消除过程和影响因素；由于取样容易和去除了其他器官的干扰，可以分别评价肝和肠的共同作用及各自作用，并可定量研究受试物及其代谢产物的消长动力学过程。这一方面在药物毒物首过效应和代谢动力学的研究中有广阔的前景。
Platzer等[21]应用循环式离体大鼠肝脏灌流技术研究抗癌药喜树碱 (Camptothecin ,CPT) 的肝脏代谢。通过反相高效液相色谱法和质谱法检测胆汁及灌流流出液中的CPT及其代谢物，发现CPT在肝脏经羟化作用产生3个经胆汁排泄的代谢物，其中M1和M2为双羟衍生物，M3为单羟衍生物。
随后Platzer等[22]又应用该模型研究了抗癌新药羟喜树碱(10-hydroxycamptothecin ,HCPT)的代谢与胆汁排泄,结果显示HCPT经肝脏生物转化产生3个代谢物，M1为HCPT葡糖醛酸苷，M2为羟化HCPT葡糖醛酸苷，M3为羟化HCPT。Salamon等[23]应用一过式离体大鼠肝脏灌流技术，对一种新型核苷酸还原酶抑制剂Amidox在肝脏的生物转化作了初步探讨。一过式肝脏灌流还特别适用于肽类药物肝脏首过效应的研究。大多数肽类药物进入系统循环之前经过了肝脏的首过代谢，所以口服后生物利用度很低；分离肝细胞、肝匀浆、肝微粒体等体外方法可揭示肽类药物肝脏代谢的机制和相关代谢酶系，但不能提供关于体内首过代谢的程度的信息。
总的来说，肝脏灌流技术作为一种与在体肝脏最具可比性的体外系统 ,有其突出的优点[24]：①可以在接近生理状况的条件下进行肝功能研究，因血流、血压或激素水平波动而引起的数据变动可降到最低限度；②保持了完整的脏器和细胞结构、肝脏的生理生化特性以及位于不同亚细胞空间的代谢通路；③排除了其他组织、脏器的干扰以及整体动物实验时的毒性问题；④能够严格控制灌流液中受试物的浓度；⑤易于采集血样或灌流液，可动态定量分析受试物及其代谢产物并进行结构鉴定。肝灌流技术亦存在一定的缺陷：如灌流实验只能在有限的时间内进行；肝脏功能受多种因素和实验条件影响，可能有手术操作、灌流液组成、流速等；手术及插管操作技术极复杂。 3 1 2 3 下一页 尾页
研究某种药物的首过效应一般都是根据药物的实际情况来设计试验。目前基本的方法有器官灌流法，建立药物动力学模型法，结合生理模型法等。
器官灌流法
由于器官灌流既能保持完整的细胞结构，获得全面的生物转化资料，又能消除整体动物实验中的某些不利因素以突出所研究器官对代谢的贡献。所以，长期以来应用于器官功能、生理反应、生化物质、能量代谢、膜屏障和转运机制等方面的研究。随着器官灌流技术的不断完善，逐渐应用于药物代谢方面的研究。在这方面肝脏灌流应用较广泛。肝脏有着丰富的酶系，它对药物可起Ⅰ相和Ⅱ相代谢反应[14]。因此肝脏灌流常用于研究药物代谢反应类型。药物经肝脏灌流发生的Ⅰ相代谢反应有饱和烃的羟化、芳烃羟化、O,N-脱烃基 、N-氧化、酰胺N-羟化、环氧化及其水化以及硝基还原；Ⅱ相代谢反应有葡糖醛酸、硫酸化、N-乙酰化以及谷胱甘肽结合。通过某些检测手段对灌流液中的代谢产物进行定性和定量，就可以了解受试化学物质在肝脏内所发生的代谢变化及反应类型。
肝脏灌流法的类型[15,16]
在各种体外方法中，肝脏灌流在实验条件上与体内方法最接近，是一种与整体肝脏最具可比性的体外模型，因此被广泛应用与药物研究。肝脏灌流按位置可分为离体及原位肝脏灌流；按灌流方式可分为循环式与一过式、正向、反向与双重灌流等。
离体肝灌流与原位肝灌流是最常用的两种灌流技术。前者完成插管手术后肝脏被摘离躯体置于特定的体外装置进行灌流，而后者则在动物躯体内、肝脏原位上进行插管手术及灌流。Mischinger[17]对离体肝灌流技术作了改进，其装置可同时进行两个离体大鼠肝脏灌流。离体灌流与原位灌流的比较显示，两者在中间代谢研究上具有等效性。原位灌流与离体灌流各有优缺点。原位灌流与体内情况的可比性较离体灌流高，其对代谢研究的范围已限于肝脏，但无法避免受肝门静脉和动脉血流、神经和激素等内源性物质对肝脏代谢的影响；离体肝灌流则不受上述因素的影响，而且采样方便，故被广泛应用于药物研究。
循环式肝灌流与一过式肝灌流是按照是否循环来分的。循环式灌流是密闭型灌流，使灌流液流回贮液池，不断循环；一过式灌流是开放性的，灌流液经过肝脏后不再循环，自下腔静脉流出。循环式肝灌流由于灌流液不断循环，因而所需的灌流液量少，但是积累的内源性代谢物有时会影响肝脏的功能。如果灌流液中含血细胞，灌流液的循环亦增加了溶血的情况。一过式肝灌流可以立即检测流出液中化学物的瞬时转变和代谢物生成，减少代谢物积累；可根据流出液中化学物质的变化评价灌流肝脏的活性、观察剂量－反应关系；且易于改变受试物浓度等实验条件。但一过式肝灌流需要大量的灌流液；而且内源性物质不断被灌流液冲洗掉，如果某些代谢过于微弱，就不易检测出其变化。肝萃取率高、代谢较快的药物宜用一过式肝灌流或增加循环式灌流中灌流液内药物的浓度，而肝萃取率低的药物宜进行循环式灌流。
正向灌流与反向灌流 根据灌流液流向不同灌流方法又有正向和反向之分。绝大多数肝脏灌流采用正向设计,即灌流液经门静脉导入,由肝静脉导出。而反向灌流由肝静脉导入,由门静脉或肝动脉导出。Pang 等[18]使用两个三通管可将正向灌流模型转换为反向灌流,并用于探测肝脏药物代谢酶的分布。尽管认为长时间(3 h) 反向灌流会损害肝脏功能, 但Pang 等通过对钾离子、SGOT、SGPT、LDH 的监测及电镜观察,发现短时间(50 min) 反向灌流对肝功能并无损害。
双重灌流 肝脏有两条供血途径：门经脉和肝动脉。通常的离体肝灌流大多只经门静脉灌流而忽略了肝动脉的作用。双重灌流既进行门经脉灌流亦进行肝动脉灌流，可更好地模拟肝脏生理体系。但由于肝动脉太细且离门经脉太近，肝动脉不能直接插管；通常是从腹腔动脉或大动脉或胃十二指肠动脉间接插管，实验操作难度较大。
器官灌流法在首过效应研究中的应用
在药物首过效应的研究中一过式灌流和循环式灌流应用广泛。阮金秀等参照Pang[20]的方法做过T2毒素在灌流大鼠肠肝中的首过效应和代谢动力学的试验，大鼠用25％乌拉坦麻醉。仰卧位固定，腹部作U字形切口，0.5×2mm的塑管从右肾动脉插管，管尖穿过腹主动脉进入上肠系膜动脉作为灌流的入口，插管固定后立即开通灌流，随即打开胸腔，右心房上作一切口。用塑管插入右心房，其尖端顺下腔静脉进入肝经脉作为灌流液出口。分别采用一过式和循环式灌流进行采样检测。一过式灌流测得T2毒素在门静脉流出液中的主要产物为HT2。T2毒素的稳态肝，肠抽提率分别为0.978和0.454，T2在标本中的总有效清除率为7.91ml. min-1接近灌流速度，表明它在通过标本的同时即可被转化。可知T2有明显的肝肠首过效应。循环式灌流测得T2毒素的主要产物HT2，3’-OHHT-2和TEOL分别在30和90分钟达到高峰。本试验的优点在于可以给标本应用体内实验不能承受的剂量，容易通过控制或改变实验条件来观察受试物在肠肝中的整个消除过程和影响因素；由于取样容易和去除了其他器官的干扰，可以分别评价肝和肠的共同作用及各自作用，并可定量研究受试物及其代谢产物的消长动力学过程。这一方面在药物毒物首过效应和代谢动力学的研究中有广阔的前景。
Platzer等[21]应用循环式离体大鼠肝脏灌流技术研究抗癌药喜树碱 (Camptothecin ,CPT) 的肝脏代谢。通过反相高效液相色谱法和质谱法检测胆汁及灌流流出液中的CPT及其代谢物，发现CPT在肝脏经羟化作用产生3个经胆汁排泄的代谢物，其中M1和M2为双羟衍生物，M3为单羟衍生物。
随后Platzer等[22]又应用该模型研究了抗癌新药羟喜树碱(10-hydroxycamptothecin ,HCPT)的代谢与胆汁排泄,结果显示HCPT经肝脏生物转化产生3个代谢物，M1为HCPT葡糖醛酸苷，M2为羟化HCPT葡糖醛酸苷，M3为羟化HCPT。Salamon等[23]应用一过式离体大鼠肝脏灌流技术，对一种新型核苷酸还原酶抑制剂Amidox在肝脏的生物转化作了初步探讨。一过式肝脏灌流还特别适用于肽类药物肝脏首过效应的研究。大多数肽类药物进入系统循环之前经过了肝脏的首过代谢，所以口服后生物利用度很低；分离肝细胞、肝匀浆、肝微粒体等体外方法可揭示肽类药物肝脏代谢的机制和相关代谢酶系，但不能提供关于体内首过代谢的程度的信息。
总的来说，肝脏灌流技术作为一种与在体肝脏最具可比性的体外系统 ,有其突出的优点[24]：①可以在接近生理状况的条件下进行肝功能研究，因血流、血压或激素水平波动而引起的数据变动可降到最低限度；②保持了完整的脏器和细胞结构、肝脏的生理生化特性以及位于不同亚细胞空间的代谢通路；③排除了其他组织、脏器的干扰以及整体动物实验时的毒性问题；④能够严格控制灌流液中受试物的浓度；⑤易于采集血样或灌流液，可动态定量分析受试物及其代谢产物并进行结构鉴定。肝灌流技术亦存在一定的缺陷：如灌流实验只能在有限的时间内进行；肝脏功能受多种因素和实验条件影响，可能有手术操作、灌流液组成、流速等；手术及插管操作技术极复杂。 3 1 2 3 下一页 尾页