1. 技术简介
随着成像技术的不断发展，出现了应用各种原理的生物观察仪器，但其中的大多数使得观察操作变得越来越复杂。研究人员一直希望用一种简便的成像技术，来观察一些特殊细胞（如肿瘤细胞等）在活体动物体内的生长、转移过程，实验动物受细菌、病毒感染过程和对药物的反应等。体内可见光成像技术，以其简便的操作及直观性成为生命科学研究的一种理想方法。
可见光体内成像是采用萤火虫的发光酶(荧光素酶，luciferase)基因（Fluc）标记细胞或基因，利用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。通过这个系统，可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物以获得数据, 得到多个时间点的实验结果。相比之下，可见光体内成像通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标（标记细胞及基因）的移动及变化，所得的数据更加真实可信。另外, 这一技术不涉及放射性物质和方法, 非常安全。因其操作极其简单、所得结果直观、灵敏度高等特点, 在刚刚发展起来的几年时间内，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。
2. 成像原理
a) 细胞标记
1995年，Contag[1]首次在小动物体内检测到带有lux操纵子的病原菌发出的可见光。他是通过CCD相机捕捉到这个被感染动物所发出的生物发光的。在1997年，他又首次观察到表达Fluc基因的转基因小鼠在注入荧光素酶底物后的生物发光现象。自此，细菌及萤火虫荧光素酶被广泛应用于小动物成像技术。
哺乳动物生物发光，是将Fluc基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。这种酶在ATP及氧气的存在条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且光的强度与标记细胞的数目线性相关。对于细菌，lux操纵子由编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成，带有这种操纵子的细菌会持续发光，不需要外源性底物（见图1）。
图1生物发光原理。将荧光素酶基因连接于启动子下游，稳定整合到细胞染色体内，使荧光素酶得到持续表达。在体内，荧光素酶在ATP、氧气存在的条件下，与外源注入的特异底物反应产生发光现象。因此仅在活细胞内才会出现荧光，且荧光强度与标记细胞数目线性相关。
基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。标记细胞的方法基本上是通过分子生物学克隆技术, 将荧光素酶的基因插到预期观察的细胞的染色体内，通过单克隆细胞技术的筛选, 培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株。目前, 常用的细胞株基本上都已标记好, 市场上已有销售。 将标记好的细胞注入小鼠体内后, 观测前需要注射荧光素酶的底物—荧光素，为约280道尔顿的小分子。荧光素脂溶性非常好, 很容易透过血脑屏障。注射一次荧光素能保持小鼠体内荧光素酶标记的细胞发光30-45分钟。每次荧光素酶催化反应只产生一个光子，这是肉眼无法观察到的，精诺真公司（Xenogen Corp.）生产的IVIS成像系统，应用一个高度灵敏的制冷CCD相机及特别设计的成像暗箱和成像软件，可观测并记录到这些光子（见图2）。
图2生物发光成像系统组成。A. 细胞、病原体及病毒均可被荧光素酶标记，小鼠携带标记的细胞及基因。B.在暗箱中由CCD相机记录生物发光。C.由成像软件定量。D.分析所得数据。
b) 技术原理: 体内透过光线的原理
光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射现象，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。血红蛋白（hemoglobin）是造成体内可见光被吸收的主要因素，其吸收可见光中蓝绿光波段的大部分。但是在可见光大于600纳米的红光波段，血红蛋白的吸收作用却很小。因此，在偏红光区域, 大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到，如图3所示。利用精诺真公司的IVIS系统最少可以看到皮下的500个细胞，当然，由于发光源在老鼠体内深度的不同可看到的最少细胞数是不同的。在相同的深度情况下, 检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系。可见光体内成像技术的基本原理在于光可以穿透实验动物的组织并且可由仪器量化检测到的光强度，同时反映出细胞的数量。
图3在波长大于600nm时，由老鼠体内发出的光是可以穿透皮肤被检测到。
3. 仪器结构及参数
以精诺真公司的IVIS100为例, 体内可见光成像系统主要由三部分组成:
图4 IVIS 100 成像系统包括: CCD数码相机及成像暗仓，配备活体成像软件及高清晰度监视器的计算机，低温制冷系统，以及相机控制器。
a) CCD镜头
选择适当的CCD镜头，对于体内可见光成像是非常重要的。选用的CCD镜头对于波长大于600nm的光必须具有非常高的灵敏度和量子效率，而且由于需要探测的光源在皮下几厘米处，其噪声信号要尽可能的小。应用于生物发光检测的主要是电子记数加强型CCD镜头，它可以在噪音很低的情况下精确记数到单个光子。尽管如此，大部分此类型CCD的量子效率在450nm时仅有10%-15%, 在650nm时减小到低于1％。例如Hamamatsu公司的 C2400-30系列。有些CCD例如 iMultialkali 的S20在大于600nm时虽然有更高的量子效率，但其噪音很大并且其需要的冷却温度很低，难以实现。怎样减少电子记数型CCD的噪音和获得更高的量子效率是仪器研发者特别关注的技术难点，解决这个问题需要利用不同的光圈和滤光镜。
更为合适的CCD是制冷型的背照射CCD。暗电流是CCD的噪音，在冷却到零下105摄氏度的条件下，暗电流降低到一个可以忽略不计的程度。以前的技术要达到零下105度的低温需要液氮冷却，现在有更好的低温设备可以方便的达到此温度。制冷型背照射CCD的信噪比可以达到要求，例如信噪比为10时，读数噪音和暗电流达到可以忽略不计的程度，并且量子效率也有非常好的表现。 2 1 2 下一页 尾页