因为第一次作肝微粒体中体外孵育实验，对操作步骤不是十分明确，参考文献也写得不是很具体，一些我们认为的关键步骤想再一次请求各位大侠给予指点：

同时做三个探针药物在肝微粒体中体外孵育实验，再生系统如下：
NADP：加入后体系中的终浓度为2.5mmol/L
6-磷酸葡萄糖：25mmol/L(同上)
葡萄糖－6-磷酸脱氢酶：加入后体系中的总量为6u
氯化镁：加入后体系中的终浓度为10mmol/L
肝微粒体：体系中的终浓度为2mg/ml，体系总体积200ul

以上各试剂加入量取自参考文献，但是我们的操作步骤不知道合不合适：将肝微粒体在37度水浴中保温3min，在再分别加入氯化镁、6-磷酸葡萄糖、葡萄糖－6-磷酸脱氢酶，再保温3min，最后加入NADP并开始计时。并且我们加入的各试剂的体积以及探针药物的体积都比较小，最大的10ul，有的为5ul。第一次作的结果十分不理想。我现在考虑是不是加入的各试剂的体积小，有可能在体系中混合不均匀，恳请各位大侠给予指点、提出宝贵建议以及该实验中的关键操作步骤等，毕业在即，十分急啊！！




我做的是肝微粒温孵试验。但是我用的是异柠檬酸脱氢酶和异柠檬酸钠。我知道的也不是太多。你是做哪方面的？是做cocktail吗？




你完全做错了。因为你用的是再生系统，所以你要先将NADP, G-6-P,G-6-PDH, MgCl2, EDTA,以及磷酸盐缓冲液混合到一起在水浴中预孵10min，这样生成NADPH之后，再放回冰上降下温来，再加入到肝微粒体中，记得此时肝微粒体也是在冰上的。然后再一起放入水浴中一起温孵。




各位的意见都比较好啊，以后可以做些参考。




可考虑直接加入NADPH辅酶（sigma有卖，roche分装的稍便宜）做反应；只需加入这一种即可。




直接买NADPH，用1%NaHCo3溶解，在2～8摄氏度下可保存3周，这样可以省去配制三种再生试剂的麻烦，再者直接买NADPH不会比买三者混合在一起的价格贵多少。我现在也是在进行这方面试验，当时为了这个问题还头疼了好长时间，现在好了，直接买NADPH解决了，实验结果还是不错的





直接买的NADPH与三者混合的相比有一些缺陷，主要是不能孵育太长时间。




你好，我想问一下你孵育系统里的6-磷酸葡萄糖，脱氢酶还有NADP的CAS号是多少？我想买，但是分不清楚是哪一种？谢谢