肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)自1975年由Carswell发现以来，一直受到世界各国学者的重视。研究表明，巨噬细胞是产生TNF的主要来源。当肝、脾等网状内皮系统受到刺激后，借助于脂多糖的帮助，TNF基因开始转录、产生并释放TNF。同时B淋巴细胞也产生一种与TNF类似的淋巴毒素；并与TNF享有共同受体。为了便于区分二者，将巨噬细胞产生的毒素称为TNF-a，淋巴细胞产生的毒素称为TNF-β。
天然人肿瘤坏死因子(natural human tumor necrosis factor alpha，n Hu TNF-a，Mr=58000)是一种非糖基化蛋白。重组人肿瘤坏死因子(recombinant human tumor necrotasfac-toralpha，rHuTNF-a，Mr=17000)由157个氨基酸组成。每个TNF-a亚单位在69位和101位含有两个半胱氨酸，形成一个链内二硫键。TNF-B(Mr=25000)亚单位的171个氨基酸中仅一个半胱氨酸，没有胱氨酸，没有二硫键。
TNF-a是迄今为止发现的抗肿瘤作用最强的细胞因子，它能特异性地直接杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞无不良影响，能抑制肿瘤细胞的增殖并促使其溶解，还可激活机体的抗肿瘤免疫反应。但是由于TNF-a能被肾快速排泄和各种蛋白酶分解作用，在体内很不稳定，半衰期很短(15～30min)，而杀伤肿瘤细胞需要12-36h。若希望通过静脉给药获得明显的抗肿瘤效果，则必须频繁大剂量注射，进而导致严重的不良反应，如：发热、恶心呕吐、头痛、低血压等。如果注射高剂量的TNF-a，能引起休克，甚至死亡。TNF-a在人体的耐受量仅为其有效量的1/10～／50。因此，用TNF-a治疗癌症被局限于肿瘤组织内给药，以获得较高的局部浓度。TNF-a的上述缺陷，为其直接进入临床使用带来了较大困难。
为了制备“高效、长效、低毒”制剂，国内外生化药学家和药剂学家进行了大量的研究工作，取得了一些新的进展。
蛋白质类药物能够快速地被肝、肾和其它器官从血中清除，其清除的速率与分子大小和蛋白水解的程度有关。水溶性大分子聚合物与蛋白质的生物连接提供了一条解决这些问题的途径，由于聚合物连接在生物大分子的表面形成空间位阻，可以不同程度地保护蛋白质，避免蛋白水解酶的水解；另外增大的分子限制了肾小球的滤过，延长蛋白质药物在血中循环的时间，减少药物在肝、脾等网状内皮系统(reticuloendothelial system，RES)器官的分布量，并且已有研究证明大分子能有效地富集和保留在肿瘤组织，提高肿瘤组织血管的渗透性，从而选择性的增强蛋白质药物的抗肿瘤活性，而不增加其不良反应。
1 高分子化学修饰TNF-a
1.1 明胶修饰
1993年Tabata等初步研究了用明胶修饰rHuTNF-a，得到的明胶TNF-a保留约55％的活性，体外抑制Meth A纤维肉瘤细胞(SS2细胞)成长的程度与TNF-a相同，小鼠体内实验表明，在血清和腹膜腔中，明胶-TNP-a的活性保持时间较TNP-a更长，使其能更长时间地与SS2细胞接触，从而增强对肿瘤细胞的生长抑制作用。
1.2 聚乙二醇修饰
近年来研究发现，用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)化学修饰生物活性蛋白质可大大延长蛋白质药物的血浆半衰期并能有效地减少免疫原性，从而提高药物的生物利用度。PEG对蛋白质、多肽类药物(proteln andpeptide drug，PPD)的连接性修饰有直接连接性修饰和间接连接性修饰之分，又有定位修饰和非定位修饰之别。直接连接性修饰反应条件剧烈，对PPD的生物活性影响较大；定位修饰往往只对特定的氨基酸残基，否则，需对肽链中的氨基酸进行突变置换处理，难度较大，迄今为止，只有对白介素-2的定位修饰取得了一定成果；非定位间接连接性修饰，主要是用活化PEG与PPD肽链中氨基酸残基的-NH2发生连接反应，因该连接反应条件温和，易于操作而被广泛采用。
日本学者Tsutsumi等对PEG(Mr=2000，5000，12000)与nHuTNF-a的非定位间接连接性修饰进行了比较详细的研究。结果表明：PEG化的程度随着反应时间的延长和PEG/TNF摩尔比的增加而增加，而体外生物活性随之降低，其原因可能是nHuTNP-a的赖氨酸残基是nHuTNF-a的活性中心或位于活性中心附近，PEG链产生的空间位阻妨碍了TNF与受休的结合。小鼠体内研究表明：在一定范围内，体内抗肿瘤活性随着PEG分子量增加而增大。与TNF-a相比，PECzooo化程度达56％(MPEO-TNF-a)时，血浆半衰期提高了40倍，抗肿瘤活性提高了近100倍，并且未发现有明显的不良反应，药物在肿瘤组织的分布量是TNF-a的9倍多。这可能是因为TNF-a上的蛋白水解部位被PEG链保护，使得TNF-a的消除率减少，药物的血浆半衰期延长，体内抗肿瘤活性增加。但是作者也发现，进一步增大PEG5000化程度达71％时，虽然半衰期进一步延长，但抗肿瘤活性近似于TNF-a，没有明显提高，作者认为当PEG-TNF-a的空间位阻增大到一定程度时，阻碍了蛋白质由血液转运到肿瘤组织并与受休结合，反而导致体内生物活性下降。
虽然PEG对nHuTNP-a的修饰克服了nHuTNF-a的一系列缺点，遗憾的址nHuTNF-a价格昂贵，来源有限。随着基因工程技术的发展，rHuTNF-a价格便宜，资源丰富，并且rHuTNF-a在体内外显示出与nHuTNF-a相类似的抗肿瘤活性。但nHuTNF-a和rHuTNF-a在分子量、氨基酸数和肽链结构等方面存在明显的差异，有必要对rHuTNF-a的化学修饰进行研究。该课题组采用3种不同分子量的SS-PEG(N-succinimidyl succlnate monomethoxy polyethylerie glycol，Mr=5000，12000，20000)对rHuTNF-a进行了连接性修饰。结果显示：与rHuTNF-a比较，PEG-rHuTNF-a的体外生物活性均有不同程度下降，在与胰蛋白酶共存时，rHuTNP-a的活性随时间的延长明显降低，但PEG-rHuTNF-a对胰蛋白酶有明显的阻抑作用。对3种分子量的PEG-rHuTNF-a主要组分在大鼠体内的药动学和在S-180实体瘤小鼠体内的组织分布及其体内抗肿瘤效果研究发现：rHuTNF-a与PEG连接后在大鼠血浆中的清除速度度明显减慢性，3种PEGrHuTNP-a的半衰期随着分子量的增加而延长，分别为rHuTNF-a的7.4，14.6和56.1倍，在S-180实体瘤小鼠肿瘤组织的分布均随着时间的增加而增加，相同剂量(25μg.kg-1)的抗肿瘤活性比较，PEG-rHuTNF-a优于rHuTNF-a，其中PEG20000-rHuTNF-a对s-180实体瘤的抑制作用最强，毒性最低，耐受性最好。随后Li等对MPEG rHuTNF-a的研究也证实了其抗肿瘤作用增大的现象，并且认为造成PEG-TNF-a体外活性降低，体内生物利用度较高的原因，可能是PEG化的TNF-a长时间在血中循环，缓慢聚集在肿瘤组织后，由于酯键的缓慢水解和体内酶降解使得一些PEG链从蛋白质中释放出来，从而使TNF-a发挥抗肿瘤活性。
1.3 聚乙烯吡咯烷酮修饰
为了设计更加有效、安全的化学修饰的TNF-a，即选择性地增强治疗活性而不增加不良反应，通过研究它们的作用机制来调节它们的体内行为是必要的。利用药物传递系统(DDS)来改进聚合物修饰物，借此来调节它们的体内行为。例如靶向能力和控制释放能力，是TNP-a制剂修饰另一研究进展。PEG作为一种普通的聚合物修饰物，其分子结构限制了它具有此种能力。
与PEG类似，聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)具有较好的生物相溶性、两亲性、无毒和无免疫原性,但其血浆半衰期比PEG更长，因此Kamada等采用PVP(Mr=6000)来修饰nHuTNF-a，发现PVP-TNF-a体外活性随着PVP化程度的增大而减小。小鼠体内研究表明：当PVP化达40％(MPVP-TNF-a)时，表现出最大的抗肿瘤活性，分别是TNDa和MPEG-TNF-a的200和5倍，且未见不良反应，半衰期(360min)大约是上述两者(4.6，122 min)的80和3倍。MPEG-TNF-a与MPVP-TNF-a的分子大小相近，但PVP的血液滞留时间却比PEG更长，作者认为，这可能与所结合的多聚物的特性有关，PVP-TNF-a可能是一种比PEG-TNF-a更加有效的抗肿瘤制剂。leatmada等正在从事各种PVP衍生物的合成工作，例如：聚二乙烯基醚马来酐(Polydininylether-maleic anhydride，DIVEMA)有许多可与蛋白质形成酰胺键的酸酐残基(PEG，PVP仅能在主链末端与蛋白质发生连接反应)，将其具有的免疫潜能和对特定组织的粑向能力引入PVP，试图制成其有DDS功能的DIVEMA-TNF-a。
2 脂质体
2.1 普通脂质体(conventional liposomes)
国叫外学者对普通脂质体作为TNF-a的载体进行了大量研究。Debs等对比研究了大鼠体内游离TNF-a与脂质体包裹TNF-a的免疫调节与细胞毒作用，发现后者作用明显，而且安全。Nii等报道TNF-a被脂质体包裹后，对靶细胞具有敏化作用，并能增强药物的作用。kedar等制备了平均粒径为0.3～2，2 μm，平均包封率为48％，由不同类脂质组成的TNF-a多室脂质体，其血浆半衰期和AUC是TNF溶液的10～20倍；在正常和荷瘤小鼠中，TNF-a脂质体的毒性分别是TNF-a溶液的1／3和1／7。Yasui等采用肿瘤组织局部注射的方法，比较了表面荷正电、荷负电的TNF-a脂质体和TNF-a溶液的体内行为，在小鼠和狗体内，上述3种制剂的抗肿瘤效果依次减小，而血中的AUC依次增大。在肿瘤组织中表面荷正电的脂质体不释放TNP-a，也就不会进入血液循环，它是通过与表面带负电的肿瘤细胞发生相互作用，从而表现出肿瘤部位的药物浓度最高，血中药物浓度最低，因此毒性最小。
上述学者虽然通过控制普通脂质体的粒径，磷脂的组成和给药途径取得了较好的抗肿瘤效果，但这些脂质体在静脉给药后迅速被单核巨噬细胞(mononuclear phagoyte system，MPS)所识别和吞噬，半衰期短，在肝、脾和淋巴结等RES器官以外肿瘤组织的分布量令人失望。因此，这种脂质体在治疗非网状内皮系统肿瘤的作用极为有限。
2.2 热敏脂质体(thermo sensitive liposomes)
1994年Oku等采用在体外肿瘤部位微波加热下，促使类脂双分子层发生相转变而释放药物的原理，制备了TNF热敏脂质体。但是，结果显示该热敏脂质体能被RES所摄取而易从血液循环中清除，而且局部加热未能促使释放出足够的TNF，而影响了抑瘤效果。为了减少RES的摄取，延长药物在血液循环的时间，2000年该研究小组Yuyama等研究了长循环热敏脂质体(1ong-circulating thermosensitive-liposomes，LCTS-liposomes)。以二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和棕榈酰基葡萄糖苷酸为材料，制得的表面修饰葡萄糖基的LCTS-liposomes，其内水相的渗透压高于体液2倍，粒径200nm，包封率为(10.3±2.0)％，小鼠体内研究表明：血浆半衰期延长；与不加热比较，TNF于42℃下从脂质体中释放到肿瘤部位而更大程度地抑制了瘤体积增长。但是肿瘤部位加热后，该脂质体也表现出了一定的毒性作用，可能是由于脂质体在血流中的突释引起TNF的血中浓度增大所致。
2.3 免疫脂质体(immunoliposomes)
研究表明，将TNF-a直接靶向到肿瘤细胞是一更好的提高疗效、降低毒性的途径。Mofishige等研究了TNF-a的免疫脂质体，在脂质体表面连接上特异性抗体，可与daudi细胞、MT-2细胞和T-24细胞表面的抗原发生特异性抗原-抗体结合，使得这些原本对TNF-a不敏感的细胞(表面无TNF-a受体)大量摄取TNF-a，从而大大抑制细胞的生长增殖。其作用机制是：脂质体结合于细胞表面后，通过内吞作用进入细胞，在溶酶体的作用下，释放出TNF-a，从而发挥TNF-a的细胞静止作用。
2.4 隐形脂质体(stealth liposomes)
鉴于普通脂质体存在上述不足，到20世纪90年代早期，在脂质体表面连接上亲水性聚合物PEG的隐形脂质体作为新一代脂质体，由于其较少被MPS识别和吞噬，开始引起人们的关注。隐形脂质体容易透过肿瘤微血管内皮间隙，因此，微血管的渗透性增加有利于脂质体在肿瘤组织的富积。1996年ten Hagen等首次报道了隐形脂质体作为TNP-a载体的研究。结果显示，TNF-a隐形脂质体的半衰期接近20h，注射给药后72h，血浆中检测到的TNF-a仍有15％，而且TNF-a在MPS较丰富组织的摄取量明显减少。与普通脂质体比较，TNF-a隐形脂质体的毒性明显降低。1998年该课题组的van der Veen等再次报道了他们的研究结果：与TNF-a溶液相比，在血中TNF-a隐形脂质体的MRT和AUC分别增加了33和14倍；在肿瘤组织中的富集(AUG)增加了13倍。但是，在大鼠体内分布实验中发现：TNF-a隐形脂质体在肝和脾中的摄取量高于肿瘤组织，这与其它文献报道不一致，作者认为这可能是由于与小鼠相比，大鼠血浆中的调理素有更大的活性，从而导致对脂质体更多的摄取。2001年Kim等也报道了TNF-a隐形脂质体联合放射治疗可显著增强抗肿瘤作用，并且更加安全。
虽然普通脂质体、物理化学靶向脂质体和主动靶向脂质体作为载体克服了TNF-a的一些缺点，取得了较好的抗肿瘤效果，但药物易泄漏和脂质体本身的稳定性较差，使其应用前景不容乐观。
3 隐形毫微粒(stealth nanopartkles)
最近几年，隐形毫微粒作为药物载体引起人们的极大兴趣。隐形毫微粒能通过PEG等对毫微粒表面的修饰制备，其特点是既具备隐形脂质体减少MPS识别几率，延长血浆半衰期的优点，又可克服药物易渗漏和脂质体稳定性较差的缺点。
本课题组选择rHuTNF-a为模型药，在国内外首次开展隐形毫微粒作为rHuTNF-a载体的探索性研究。我们选用相对Mr为5000的单甲氧基聚乙二醇(monomethoxy-polyethylene glycol，MePEG)为材料，合成了聚乙二醇化聚十六烷基氰基丙烯酸酯(PEG-PHDCA)，以PEG-PHDCA为载体材料，用二次乳化法制备rHuTNF-a的隐形毫微粒。另外，还以PHDCA为材料制备的rHuTNF-a普通毫微粒作为对照。结果显示，隐形毫微粒包封率在50％左右，毫微粒形态呈圆形，接近正态分布，在100-200 nm间的隐形毫微粒占90％(粒径范围40～400nm)，Zeta电位平均值为-9.059mV；隐形毫微粒体外释药特性呈现一开始的突释过程和随后的缓慢释放过程，体外释药较好地符合双指数模型，缓释阶段的释放数据较好地符合零级动力学过程。药动学和体内抗肿瘤活性研究发现：rHuTNF-a隐形毫微粒在大鼠的血浆中清除缓慢，t1/2为5.9h，为对照毫微粒的24倍。隐形毫微粒在S-100实体瘤小鼠肿瘤组织的分布量大于对照毫微粒，并且随时间的增加而增加。与等剂量的对照毫微粒和rHuTNF-a(0.5μg/20g体重)比较，隐形毫微粒显示最强的抗S-180实体瘤活性和最好的耐受性。
4 结 语
为了克服抗肿瘤剂—肿瘤坏死因子严重的不良反应，使其尽早应用于临床，目前国内外学者对其的制剂研究主要集中在高分子化学修饰和药物载体传递系统两方面，无论采取何种手段，其最终目的有二：一是减少RES的摄取，延长药物血中半衰期；二是提高药物的靶向性，降低不良反应。
在化学修饰方面，目前研究的热点主要集中在对肿瘤坏死因子的PEG修饰上，但是还有许多问题需要探讨和解决，例如：①与游离TNF-a相比，虽然PEG-TNF-a在肿瘤组织的药物浓度显著提高，但却低于在肝、脾等RES器官的药物浓度，所以靶向性有待进一步提高。②空间位阻不仅保护生物活性蛋白质免受蛋白酶的分解，而且也阻碍了它们与受体结合。为了平衡组织转运、受体结合和血浆清除率的关系，最好是采用对蛋白质活性不损失的定位修饰方法。但该技术难度较大，需要进一步研究。
在药物载体传递系统研究方面，有许多类型的脂质体报道，免疫脂质体由于能特异性的靶向于肿瘤细胞，似乎是一较好的方法，但这方面的研究报道不多，可能还存在一些未能解决的问题。然而无论何种脂质体目前均存在不稳定、泄漏快及储存期变质的缺点，因此发展受到相当的限制。采用生物降解材料制备TNF-a隐形毫微粒，因其可有效减少RES的摄取、缓释长效、对靶组织有明显的富集作用，而且可能役有脂质体易泄漏、稳定性差的问题，应用前景令人乐观。但还存在一些问题有待进一步研究和确证，如怎样完全避免各种因素对rHuTNF-a生物活性的影响，如何进一步提高隐形毫微粒的包封率和载药量，怎样避免突释现象，储存期间的稳定性如何等等。随着上述问题的进一步探讨、研究和解决，必将进一步提高TNF-a等蛋白质、多肽类药物的临床疗效，降低毒性，同时对药剂学的发展也将起到更大的促进作用。
天然人肿瘤坏死因子(natural human tumor necrosis factor alpha，n Hu TNF-a，Mr=58000)是一种非糖基化蛋白。重组人肿瘤坏死因子(recombinant human tumor necrotasfac-toralpha，rHuTNF-a，Mr=17000)由157个氨基酸组成。每个TNF-a亚单位在69位和101位含有两个半胱氨酸，形成一个链内二硫键。TNF-B(Mr=25000)亚单位的171个氨基酸中仅一个半胱氨酸，没有胱氨酸，没有二硫键。
TNF-a是迄今为止发现的抗肿瘤作用最强的细胞因子，它能特异性地直接杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞无不良影响，能抑制肿瘤细胞的增殖并促使其溶解，还可激活机体的抗肿瘤免疫反应。但是由于TNF-a能被肾快速排泄和各种蛋白酶分解作用，在体内很不稳定，半衰期很短(15～30min)，而杀伤肿瘤细胞需要12-36h。若希望通过静脉给药获得明显的抗肿瘤效果，则必须频繁大剂量注射，进而导致严重的不良反应，如：发热、恶心呕吐、头痛、低血压等。如果注射高剂量的TNF-a，能引起休克，甚至死亡。TNF-a在人体的耐受量仅为其有效量的1/10～／50。因此，用TNF-a治疗癌症被局限于肿瘤组织内给药，以获得较高的局部浓度。TNF-a的上述缺陷，为其直接进入临床使用带来了较大困难。
为了制备“高效、长效、低毒”制剂，国内外生化药学家和药剂学家进行了大量的研究工作，取得了一些新的进展。
蛋白质类药物能够快速地被肝、肾和其它器官从血中清除，其清除的速率与分子大小和蛋白水解的程度有关。水溶性大分子聚合物与蛋白质的生物连接提供了一条解决这些问题的途径，由于聚合物连接在生物大分子的表面形成空间位阻，可以不同程度地保护蛋白质，避免蛋白水解酶的水解；另外增大的分子限制了肾小球的滤过，延长蛋白质药物在血中循环的时间，减少药物在肝、脾等网状内皮系统(reticuloendothelial system，RES)器官的分布量，并且已有研究证明大分子能有效地富集和保留在肿瘤组织，提高肿瘤组织血管的渗透性，从而选择性的增强蛋白质药物的抗肿瘤活性，而不增加其不良反应。
1 高分子化学修饰TNF-a
1.1 明胶修饰
1993年Tabata等初步研究了用明胶修饰rHuTNF-a，得到的明胶TNF-a保留约55％的活性，体外抑制Meth A纤维肉瘤细胞(SS2细胞)成长的程度与TNF-a相同，小鼠体内实验表明，在血清和腹膜腔中，明胶-TNP-a的活性保持时间较TNP-a更长，使其能更长时间地与SS2细胞接触，从而增强对肿瘤细胞的生长抑制作用。
1.2 聚乙二醇修饰
近年来研究发现，用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)化学修饰生物活性蛋白质可大大延长蛋白质药物的血浆半衰期并能有效地减少免疫原性，从而提高药物的生物利用度。PEG对蛋白质、多肽类药物(proteln andpeptide drug，PPD)的连接性修饰有直接连接性修饰和间接连接性修饰之分，又有定位修饰和非定位修饰之别。直接连接性修饰反应条件剧烈，对PPD的生物活性影响较大；定位修饰往往只对特定的氨基酸残基，否则，需对肽链中的氨基酸进行突变置换处理，难度较大，迄今为止，只有对白介素-2的定位修饰取得了一定成果；非定位间接连接性修饰，主要是用活化PEG与PPD肽链中氨基酸残基的-NH2发生连接反应，因该连接反应条件温和，易于操作而被广泛采用。
日本学者Tsutsumi等对PEG(Mr=2000，5000，12000)与nHuTNF-a的非定位间接连接性修饰进行了比较详细的研究。结果表明：PEG化的程度随着反应时间的延长和PEG/TNF摩尔比的增加而增加，而体外生物活性随之降低，其原因可能是nHuTNP-a的赖氨酸残基是nHuTNF-a的活性中心或位于活性中心附近，PEG链产生的空间位阻妨碍了TNF与受休的结合。小鼠体内研究表明：在一定范围内，体内抗肿瘤活性随着PEG分子量增加而增大。与TNF-a相比，PECzooo化程度达56％(MPEO-TNF-a)时，血浆半衰期提高了40倍，抗肿瘤活性提高了近100倍，并且未发现有明显的不良反应，药物在肿瘤组织的分布量是TNF-a的9倍多。这可能是因为TNF-a上的蛋白水解部位被PEG链保护，使得TNF-a的消除率减少，药物的血浆半衰期延长，体内抗肿瘤活性增加。但是作者也发现，进一步增大PEG5000化程度达71％时，虽然半衰期进一步延长，但抗肿瘤活性近似于TNF-a，没有明显提高，作者认为当PEG-TNF-a的空间位阻增大到一定程度时，阻碍了蛋白质由血液转运到肿瘤组织并与受休结合，反而导致体内生物活性下降。
虽然PEG对nHuTNP-a的修饰克服了nHuTNF-a的一系列缺点，遗憾的址nHuTNF-a价格昂贵，来源有限。随着基因工程技术的发展，rHuTNF-a价格便宜，资源丰富，并且rHuTNF-a在体内外显示出与nHuTNF-a相类似的抗肿瘤活性。但nHuTNF-a和rHuTNF-a在分子量、氨基酸数和肽链结构等方面存在明显的差异，有必要对rHuTNF-a的化学修饰进行研究。该课题组采用3种不同分子量的SS-PEG(N-succinimidyl succlnate monomethoxy polyethylerie glycol，Mr=5000，12000，20000)对rHuTNF-a进行了连接性修饰。结果显示：与rHuTNF-a比较，PEG-rHuTNF-a的体外生物活性均有不同程度下降，在与胰蛋白酶共存时，rHuTNP-a的活性随时间的延长明显降低，但PEG-rHuTNF-a对胰蛋白酶有明显的阻抑作用。对3种分子量的PEG-rHuTNF-a主要组分在大鼠体内的药动学和在S-180实体瘤小鼠体内的组织分布及其体内抗肿瘤效果研究发现：rHuTNF-a与PEG连接后在大鼠血浆中的清除速度度明显减慢性，3种PEGrHuTNP-a的半衰期随着分子量的增加而延长，分别为rHuTNF-a的7.4，14.6和56.1倍，在S-180实体瘤小鼠肿瘤组织的分布均随着时间的增加而增加，相同剂量(25μg.kg-1)的抗肿瘤活性比较，PEG-rHuTNF-a优于rHuTNF-a，其中PEG20000-rHuTNF-a对s-180实体瘤的抑制作用最强，毒性最低，耐受性最好。随后Li等对MPEG rHuTNF-a的研究也证实了其抗肿瘤作用增大的现象，并且认为造成PEG-TNF-a体外活性降低，体内生物利用度较高的原因，可能是PEG化的TNF-a长时间在血中循环，缓慢聚集在肿瘤组织后，由于酯键的缓慢水解和体内酶降解使得一些PEG链从蛋白质中释放出来，从而使TNF-a发挥抗肿瘤活性。
1.3 聚乙烯吡咯烷酮修饰
为了设计更加有效、安全的化学修饰的TNF-a，即选择性地增强治疗活性而不增加不良反应，通过研究它们的作用机制来调节它们的体内行为是必要的。利用药物传递系统(DDS)来改进聚合物修饰物，借此来调节它们的体内行为。例如靶向能力和控制释放能力，是TNP-a制剂修饰另一研究进展。PEG作为一种普通的聚合物修饰物，其分子结构限制了它具有此种能力。
与PEG类似，聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)具有较好的生物相溶性、两亲性、无毒和无免疫原性,但其血浆半衰期比PEG更长，因此Kamada等采用PVP(Mr=6000)来修饰nHuTNF-a，发现PVP-TNF-a体外活性随着PVP化程度的增大而减小。小鼠体内研究表明：当PVP化达40％(MPVP-TNF-a)时，表现出最大的抗肿瘤活性，分别是TNDa和MPEG-TNF-a的200和5倍，且未见不良反应，半衰期(360min)大约是上述两者(4.6，122 min)的80和3倍。MPEG-TNF-a与MPVP-TNF-a的分子大小相近，但PVP的血液滞留时间却比PEG更长，作者认为，这可能与所结合的多聚物的特性有关，PVP-TNF-a可能是一种比PEG-TNF-a更加有效的抗肿瘤制剂。leatmada等正在从事各种PVP衍生物的合成工作，例如：聚二乙烯基醚马来酐(Polydininylether-maleic anhydride，DIVEMA)有许多可与蛋白质形成酰胺键的酸酐残基(PEG，PVP仅能在主链末端与蛋白质发生连接反应)，将其具有的免疫潜能和对特定组织的粑向能力引入PVP，试图制成其有DDS功能的DIVEMA-TNF-a。
2 脂质体
2.1 普通脂质体(conventional liposomes)
国叫外学者对普通脂质体作为TNF-a的载体进行了大量研究。Debs等对比研究了大鼠体内游离TNF-a与脂质体包裹TNF-a的免疫调节与细胞毒作用，发现后者作用明显，而且安全。Nii等报道TNF-a被脂质体包裹后，对靶细胞具有敏化作用，并能增强药物的作用。kedar等制备了平均粒径为0.3～2，2 μm，平均包封率为48％，由不同类脂质组成的TNF-a多室脂质体，其血浆半衰期和AUC是TNF溶液的10～20倍；在正常和荷瘤小鼠中，TNF-a脂质体的毒性分别是TNF-a溶液的1／3和1／7。Yasui等采用肿瘤组织局部注射的方法，比较了表面荷正电、荷负电的TNF-a脂质体和TNF-a溶液的体内行为，在小鼠和狗体内，上述3种制剂的抗肿瘤效果依次减小，而血中的AUC依次增大。在肿瘤组织中表面荷正电的脂质体不释放TNP-a，也就不会进入血液循环，它是通过与表面带负电的肿瘤细胞发生相互作用，从而表现出肿瘤部位的药物浓度最高，血中药物浓度最低，因此毒性最小。
上述学者虽然通过控制普通脂质体的粒径，磷脂的组成和给药途径取得了较好的抗肿瘤效果，但这些脂质体在静脉给药后迅速被单核巨噬细胞(mononuclear phagoyte system，MPS)所识别和吞噬，半衰期短，在肝、脾和淋巴结等RES器官以外肿瘤组织的分布量令人失望。因此，这种脂质体在治疗非网状内皮系统肿瘤的作用极为有限。
2.2 热敏脂质体(thermo sensitive liposomes)
1994年Oku等采用在体外肿瘤部位微波加热下，促使类脂双分子层发生相转变而释放药物的原理，制备了TNF热敏脂质体。但是，结果显示该热敏脂质体能被RES所摄取而易从血液循环中清除，而且局部加热未能促使释放出足够的TNF，而影响了抑瘤效果。为了减少RES的摄取，延长药物在血液循环的时间，2000年该研究小组Yuyama等研究了长循环热敏脂质体(1ong-circulating thermosensitive-liposomes，LCTS-liposomes)。以二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和棕榈酰基葡萄糖苷酸为材料，制得的表面修饰葡萄糖基的LCTS-liposomes，其内水相的渗透压高于体液2倍，粒径200nm，包封率为(10.3±2.0)％，小鼠体内研究表明：血浆半衰期延长；与不加热比较，TNF于42℃下从脂质体中释放到肿瘤部位而更大程度地抑制了瘤体积增长。但是肿瘤部位加热后，该脂质体也表现出了一定的毒性作用，可能是由于脂质体在血流中的突释引起TNF的血中浓度增大所致。
2.3 免疫脂质体(immunoliposomes)
研究表明，将TNF-a直接靶向到肿瘤细胞是一更好的提高疗效、降低毒性的途径。Mofishige等研究了TNF-a的免疫脂质体，在脂质体表面连接上特异性抗体，可与daudi细胞、MT-2细胞和T-24细胞表面的抗原发生特异性抗原-抗体结合，使得这些原本对TNF-a不敏感的细胞(表面无TNF-a受体)大量摄取TNF-a，从而大大抑制细胞的生长增殖。其作用机制是：脂质体结合于细胞表面后，通过内吞作用进入细胞，在溶酶体的作用下，释放出TNF-a，从而发挥TNF-a的细胞静止作用。
2.4 隐形脂质体(stealth liposomes)
鉴于普通脂质体存在上述不足，到20世纪90年代早期，在脂质体表面连接上亲水性聚合物PEG的隐形脂质体作为新一代脂质体，由于其较少被MPS识别和吞噬，开始引起人们的关注。隐形脂质体容易透过肿瘤微血管内皮间隙，因此，微血管的渗透性增加有利于脂质体在肿瘤组织的富积。1996年ten Hagen等首次报道了隐形脂质体作为TNP-a载体的研究。结果显示，TNF-a隐形脂质体的半衰期接近20h，注射给药后72h，血浆中检测到的TNF-a仍有15％，而且TNF-a在MPS较丰富组织的摄取量明显减少。与普通脂质体比较，TNF-a隐形脂质体的毒性明显降低。1998年该课题组的van der Veen等再次报道了他们的研究结果：与TNF-a溶液相比，在血中TNF-a隐形脂质体的MRT和AUC分别增加了33和14倍；在肿瘤组织中的富集(AUG)增加了13倍。但是，在大鼠体内分布实验中发现：TNF-a隐形脂质体在肝和脾中的摄取量高于肿瘤组织，这与其它文献报道不一致，作者认为这可能是由于与小鼠相比，大鼠血浆中的调理素有更大的活性，从而导致对脂质体更多的摄取。2001年Kim等也报道了TNF-a隐形脂质体联合放射治疗可显著增强抗肿瘤作用，并且更加安全。
虽然普通脂质体、物理化学靶向脂质体和主动靶向脂质体作为载体克服了TNF-a的一些缺点，取得了较好的抗肿瘤效果，但药物易泄漏和脂质体本身的稳定性较差，使其应用前景不容乐观。
3 隐形毫微粒(stealth nanopartkles)
最近几年，隐形毫微粒作为药物载体引起人们的极大兴趣。隐形毫微粒能通过PEG等对毫微粒表面的修饰制备，其特点是既具备隐形脂质体减少MPS识别几率，延长血浆半衰期的优点，又可克服药物易渗漏和脂质体稳定性较差的缺点。
本课题组选择rHuTNF-a为模型药，在国内外首次开展隐形毫微粒作为rHuTNF-a载体的探索性研究。我们选用相对Mr为5000的单甲氧基聚乙二醇(monomethoxy-polyethylene glycol，MePEG)为材料，合成了聚乙二醇化聚十六烷基氰基丙烯酸酯(PEG-PHDCA)，以PEG-PHDCA为载体材料，用二次乳化法制备rHuTNF-a的隐形毫微粒。另外，还以PHDCA为材料制备的rHuTNF-a普通毫微粒作为对照。结果显示，隐形毫微粒包封率在50％左右，毫微粒形态呈圆形，接近正态分布，在100-200 nm间的隐形毫微粒占90％(粒径范围40～400nm)，Zeta电位平均值为-9.059mV；隐形毫微粒体外释药特性呈现一开始的突释过程和随后的缓慢释放过程，体外释药较好地符合双指数模型，缓释阶段的释放数据较好地符合零级动力学过程。药动学和体内抗肿瘤活性研究发现：rHuTNF-a隐形毫微粒在大鼠的血浆中清除缓慢，t1/2为5.9h，为对照毫微粒的24倍。隐形毫微粒在S-100实体瘤小鼠肿瘤组织的分布量大于对照毫微粒，并且随时间的增加而增加。与等剂量的对照毫微粒和rHuTNF-a(0.5μg/20g体重)比较，隐形毫微粒显示最强的抗S-180实体瘤活性和最好的耐受性。
4 结 语
为了克服抗肿瘤剂—肿瘤坏死因子严重的不良反应，使其尽早应用于临床，目前国内外学者对其的制剂研究主要集中在高分子化学修饰和药物载体传递系统两方面，无论采取何种手段，其最终目的有二：一是减少RES的摄取，延长药物血中半衰期；二是提高药物的靶向性，降低不良反应。
在化学修饰方面，目前研究的热点主要集中在对肿瘤坏死因子的PEG修饰上，但是还有许多问题需要探讨和解决，例如：①与游离TNF-a相比，虽然PEG-TNF-a在肿瘤组织的药物浓度显著提高，但却低于在肝、脾等RES器官的药物浓度，所以靶向性有待进一步提高。②空间位阻不仅保护生物活性蛋白质免受蛋白酶的分解，而且也阻碍了它们与受体结合。为了平衡组织转运、受体结合和血浆清除率的关系，最好是采用对蛋白质活性不损失的定位修饰方法。但该技术难度较大，需要进一步研究。
在药物载体传递系统研究方面，有许多类型的脂质体报道，免疫脂质体由于能特异性的靶向于肿瘤细胞，似乎是一较好的方法，但这方面的研究报道不多，可能还存在一些未能解决的问题。然而无论何种脂质体目前均存在不稳定、泄漏快及储存期变质的缺点，因此发展受到相当的限制。采用生物降解材料制备TNF-a隐形毫微粒，因其可有效减少RES的摄取、缓释长效、对靶组织有明显的富集作用，而且可能役有脂质体易泄漏、稳定性差的问题，应用前景令人乐观。但还存在一些问题有待进一步研究和确证，如怎样完全避免各种因素对rHuTNF-a生物活性的影响，如何进一步提高隐形毫微粒的包封率和载药量，怎样避免突释现象，储存期间的稳定性如何等等。随着上述问题的进一步探讨、研究和解决，必将进一步提高TNF-a等蛋白质、多肽类药物的临床疗效，降低毒性，同时对药剂学的发展也将起到更大的促进作用。