各位老师，我现在按照10版药典上的含量测定方法进行测定，结果很不理想，胰岛素的检测波长214nm，流动相是硫酸钠缓冲盐和乙腈（74:28），如果按照这个比例，出来的峰型不合格，峰太宽，理论塔板数不到2000，我现在把比例调到70:30，峰型是合格了，但是峰跟水的倒峰连在一起了，我是真的不知道胰岛素含量该怎么测定了?还有一个问题，硫酸钠需要用色谱级的吗？我现在用的是分析纯的
需要各位老师的指点，谢谢大家了
这个问题，我有发言权，我目前在做这方面的研究，对于你第二个问题，我认为不需要用色谱级的，分析纯的就可以了，我用的也是分析纯。其次，色谱条件也不需要做改变。你可以更换下色谱柱，先按药典要求，考察下系统使用性。最后，我想说的是胰岛素对流动相极性大小非常敏感，柱温对其保留时间也有很大的影响。
我目前做出来的峰型很好，拖尾因子约为1.1
你的流动相是按药典要求配制的吗，水相ph是2.3吗，水相和乙腈的比是74:26？
首先谢谢你回复我的帖子，我看到希望了，嘻嘻。。。我是按照药典的方法配制的，胰岛素是太敏感了，我做了好长时间才稳定下来，我用药典的比例，做出来的峰是符合正态分布的，但理论塔板数都在2000左右，不合格，所以我才考虑加大有机相的比例，让保留时间提前，我用的是安捷伦的高效液相色谱，请问您的保留时间是多少分钟啊？还有你用的哪一型号的柱子啊？我要找到原因，然后向导师申请换柱子，要不然真的要疯了。。。谢谢了
不同的柱子以及柱子长短，主峰出峰时间是不同的，你把你的实验条件色谱条件以及按照什么药典告诉我，我帮你分析。我目前做的胰岛素峰型很好，塔板数在6000以上。你说的理论塔板数不合格，你是根据什么标准来判断说塔板数2000，就是不合格的，据我所知，判断胰岛素的系统适用性是否合格，好像没有理论塔板数的要求。你说的塔板数在2000左右，只能说效果不好，条件不太适合，有些时候，不是说保留时间提前了，塔板数就一定会提高，不能这么绝对。同样的是胰岛素，保留时间在12min左右和在30min左右时，塔板数就差别很大，用的是同一色谱柱，你可能会认为12min时塔板数高，事实情况，正好相反。12min时，塔板数才4000不到。
这是系统适用性的图谱
柱：C18型号的
我的色谱条件：Hadera OSD-2 C18液相色谱柱（259mm×4.6mm,5um)
流动相：流动相A0.2mol/L硫酸盐缓冲液
流动相B乙腈（A:B=74:26)
柱温为40℃；检测波长为214nm,进样20ul. 这是2010版药典第二部规定的色谱条件
我的出峰时间3.4min，我没有什么依据来确定理论塔板数，只是理论塔板数低了，分离的不好并且峰型也特别难看啊，药典一般规定理论塔板数在2500以上，所以也想这么要求自己也能达到这个条件。我所说的出峰时间越快理论塔板数越高，是因为我做出来就是这样啊，还有如果我的胰岛素峰在6min以后出峰的话，理论塔板数就是1000-2000左右，所以真的是疯了，不知道该怎么办了，请帮帮我吧
我的QQ号：66666666
版主111留言:
药学区严禁留联系方式
“药典一般规定理论塔板数在2500以上”，你从药典中哪里看到的？ 其次，我建议你多看看药典，把药典中规定需要满足的条件满足了。其次，我对于你说的用长柱子来进行分析，得出的主峰出峰时间怎么那么短，感到惊讶。我曾经摸索条件时，用手头现有的长柱子试时，主峰保留时间太长，好像都有一个小时。你需要更换柱子了，你更换短柱子试试吧。这个药是很老的药了，中国药典说的都是很模糊的，美国药典上收载的该药，信息就比较全面，多看看美国药典，会对你有所帮助。
还有就是通过你的描述，我觉得你应该是在安捷伦液相上采用双泵进行低压梯度混合后进行的，倘若是这样做的，行吗？我没有试过，也不愿去试，担心盐析出堵塞管路。但通过看药典，说配制该流动相需保证温度在25度以上，以防析晶，据此，我认为是先把流动相按比例混匀好后再进行样品分析，而不是采用双泵进行混合。
我用的就是短柱子。
有一点说错了：“但通过看药典，说配制该流动相需保证温度在25度以上，以防析晶，”------是保证温度在20度以上
我明白了，那我换一根短柱试一下，谢咯
还有一个问题，你说把缓冲盐和乙腈混合好了与用两个泵混合，有什么区别吗？温度应该不会变啊，都是在同一个实验室，用同一台仪器做，还有就现在这个温度，应该不会有结晶析出来吧。我以前用岛津的仪器也是混合好了做，但总觉得用量筒不太准，也很麻烦，也不能控制柱温，所以就换两个泵的安捷伦了。
请教一下，购买短柱时（除了能适合大分子蛋白测定的色谱柱，适宜的PH值范围）还应注意什么问题啊？
药典上说的A21胰岛素是胰岛素放久了之后的杂质吗？你做出来过这样的两个峰（胰岛素峰和A21胰岛素峰）？
对于你说的第一个问题：首先我没有按你说的用双泵来进行流动相的配制，不好回答。你不妨试下两者的差异，如果没有差异，也没有析晶堵塞管路，那就按你说的那样做也无妨。去年冬天刚做该药的时候，记得好像还是有关物质检测时配制流动相时，就出现这析晶现象。
对于色谱柱购买这块：我的也就是普通的色谱柱。耐受低pH也就行了。
对于你的第二个问题：想更正下你的说法，A21脱氨基胰岛素不是杂质，请仔细看药典。对照品室温下至少放置24h后会有A21脱氨基胰岛素。我的是图谱中是有，请见我之前发的回帖。
需要各位老师的指点，谢谢大家了
这个问题，我有发言权，我目前在做这方面的研究，对于你第二个问题，我认为不需要用色谱级的，分析纯的就可以了，我用的也是分析纯。其次，色谱条件也不需要做改变。你可以更换下色谱柱，先按药典要求，考察下系统使用性。最后，我想说的是胰岛素对流动相极性大小非常敏感，柱温对其保留时间也有很大的影响。
我目前做出来的峰型很好，拖尾因子约为1.1
你的流动相是按药典要求配制的吗，水相ph是2.3吗，水相和乙腈的比是74:26？
首先谢谢你回复我的帖子，我看到希望了，嘻嘻。。。我是按照药典的方法配制的，胰岛素是太敏感了，我做了好长时间才稳定下来，我用药典的比例，做出来的峰是符合正态分布的，但理论塔板数都在2000左右，不合格，所以我才考虑加大有机相的比例，让保留时间提前，我用的是安捷伦的高效液相色谱，请问您的保留时间是多少分钟啊？还有你用的哪一型号的柱子啊？我要找到原因，然后向导师申请换柱子，要不然真的要疯了。。。谢谢了
不同的柱子以及柱子长短，主峰出峰时间是不同的，你把你的实验条件色谱条件以及按照什么药典告诉我，我帮你分析。我目前做的胰岛素峰型很好，塔板数在6000以上。你说的理论塔板数不合格，你是根据什么标准来判断说塔板数2000，就是不合格的，据我所知，判断胰岛素的系统适用性是否合格，好像没有理论塔板数的要求。你说的塔板数在2000左右，只能说效果不好，条件不太适合，有些时候，不是说保留时间提前了，塔板数就一定会提高，不能这么绝对。同样的是胰岛素，保留时间在12min左右和在30min左右时，塔板数就差别很大，用的是同一色谱柱，你可能会认为12min时塔板数高，事实情况，正好相反。12min时，塔板数才4000不到。
这是系统适用性的图谱
柱：C18型号的
我的色谱条件：Hadera OSD-2 C18液相色谱柱（259mm×4.6mm,5um)
流动相：流动相A0.2mol/L硫酸盐缓冲液
流动相B乙腈（A:B=74:26)
柱温为40℃；检测波长为214nm,进样20ul. 这是2010版药典第二部规定的色谱条件
我的出峰时间3.4min，我没有什么依据来确定理论塔板数，只是理论塔板数低了，分离的不好并且峰型也特别难看啊，药典一般规定理论塔板数在2500以上，所以也想这么要求自己也能达到这个条件。我所说的出峰时间越快理论塔板数越高，是因为我做出来就是这样啊，还有如果我的胰岛素峰在6min以后出峰的话，理论塔板数就是1000-2000左右，所以真的是疯了，不知道该怎么办了，请帮帮我吧
我的QQ号：66666666
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“药典一般规定理论塔板数在2500以上”，你从药典中哪里看到的？ 其次，我建议你多看看药典，把药典中规定需要满足的条件满足了。其次，我对于你说的用长柱子来进行分析，得出的主峰出峰时间怎么那么短，感到惊讶。我曾经摸索条件时，用手头现有的长柱子试时，主峰保留时间太长，好像都有一个小时。你需要更换柱子了，你更换短柱子试试吧。这个药是很老的药了，中国药典说的都是很模糊的，美国药典上收载的该药，信息就比较全面，多看看美国药典，会对你有所帮助。
还有就是通过你的描述，我觉得你应该是在安捷伦液相上采用双泵进行低压梯度混合后进行的，倘若是这样做的，行吗？我没有试过，也不愿去试，担心盐析出堵塞管路。但通过看药典，说配制该流动相需保证温度在25度以上，以防析晶，据此，我认为是先把流动相按比例混匀好后再进行样品分析，而不是采用双泵进行混合。
我用的就是短柱子。
有一点说错了：“但通过看药典，说配制该流动相需保证温度在25度以上，以防析晶，”------是保证温度在20度以上
我明白了，那我换一根短柱试一下，谢咯
还有一个问题，你说把缓冲盐和乙腈混合好了与用两个泵混合，有什么区别吗？温度应该不会变啊，都是在同一个实验室，用同一台仪器做，还有就现在这个温度，应该不会有结晶析出来吧。我以前用岛津的仪器也是混合好了做，但总觉得用量筒不太准，也很麻烦，也不能控制柱温，所以就换两个泵的安捷伦了。
请教一下，购买短柱时（除了能适合大分子蛋白测定的色谱柱，适宜的PH值范围）还应注意什么问题啊？
药典上说的A21胰岛素是胰岛素放久了之后的杂质吗？你做出来过这样的两个峰（胰岛素峰和A21胰岛素峰）？
对于你说的第一个问题：首先我没有按你说的用双泵来进行流动相的配制，不好回答。你不妨试下两者的差异，如果没有差异，也没有析晶堵塞管路，那就按你说的那样做也无妨。去年冬天刚做该药的时候，记得好像还是有关物质检测时配制流动相时，就出现这析晶现象。
对于色谱柱购买这块：我的也就是普通的色谱柱。耐受低pH也就行了。
对于你的第二个问题：想更正下你的说法，A21脱氨基胰岛素不是杂质，请仔细看药典。对照品室温下至少放置24h后会有A21脱氨基胰岛素。我的是图谱中是有，请见我之前发的回帖。