最近一直在做精氨酸的回收率，结果一直不好，特向大家请教：
1 配2.5uM的精氨酸标准品：用PBS或者水稀释，取0.5ml, 然后加丙酮或者甲醇定容到2.5ml 或者3ml(模仿用丙酮或者甲醇沉淀蛋白).
2 活化Anpelclean MCX混合型阳离子交换柱：
1）依次用3ml甲醇和3ml去离子水活化
2）2.5ml或者3ml精氨酸标准品过柱，接过柱的液体。
3）用3ml 0.1M HCL 洗柱
4) 用3ml 甲醇洗柱
5）洗脱： 我们用的氨水浓度为25%-28%
6ml 的 氨水：水：甲醇=10：40：50 洗脱，每3ml接一管
或含55%/70%/80%/90%氨水的甲醇溶液，甚至100%的氨水洗脱。也是每3ml接一管，分别接2管。
3 氮吹仪吹干
4 PITC 衍生，室温10min，进样检测。
5 结果：1）精氨酸标准品过柱接的液体中没有精氨酸 ，说明精氨酸是结合到柱上，没有流出
2）用10：40：50 的洗脱浓度，第一管回收率为55%-60%，第二管非常少，说明回收干净了，但为什么回收率只有一半了？
3）含55%氨水的甲醇溶液，洗脱回收的第一管也是55%-60%，第二管几乎没有，问题同上。
4）含70%/80%/90%氨水的甲醇溶液，甚至100%的氨水，回收的峰非常大，与其左右的峰相连，回收率可能有百分之几百。
是不是柱子本身就吸附部分精氨酸，洗不下来，要换个高点的浓度做做？正在试验中。。。。。
自己顶下，
换了25uM 的浓度，测了回收率是130%，真是不知道问题出哪了？
可不可以不用过柱回收，直接将样品如组织，血清，细胞等除去蛋白后直接吹干，做液相色谱。
我已经用组织的样品这样做过，4倍丙酮除去蛋白后，上清吹干，衍生，测定，结果精氨酸的峰与周围的峰分不开，各位可有好的洗脱条件或其它办法？？？？
盼回复。
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版主111留言:
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做事情总的一步一步来。首先呢，先看看精氨酸回收率如何能达到要求，先考虑直接沉淀蛋白，比如高氯酸什么的，看看加标回收率如何，当然可以先拿精氨酸的谁溶液来试试，用个简单的HPLC方法看看，不要衍生，精氨酸低波长还是有一定的紫外吸收的。等它回收合格了，再看看衍生化后的峰在哪里，摸索衍生化条件，成熟以后，重新考察回收率，满足要求，可以进行实际样品分析了。
1 配2.5uM的精氨酸标准品：用PBS或者水稀释，取0.5ml, 然后加丙酮或者甲醇定容到2.5ml 或者3ml(模仿用丙酮或者甲醇沉淀蛋白).
2 活化Anpelclean MCX混合型阳离子交换柱：
1）依次用3ml甲醇和3ml去离子水活化
2）2.5ml或者3ml精氨酸标准品过柱，接过柱的液体。
3）用3ml 0.1M HCL 洗柱
4) 用3ml 甲醇洗柱
5）洗脱： 我们用的氨水浓度为25%-28%
6ml 的 氨水：水：甲醇=10：40：50 洗脱，每3ml接一管
或含55%/70%/80%/90%氨水的甲醇溶液，甚至100%的氨水洗脱。也是每3ml接一管，分别接2管。
3 氮吹仪吹干
4 PITC 衍生，室温10min，进样检测。
5 结果：1）精氨酸标准品过柱接的液体中没有精氨酸 ，说明精氨酸是结合到柱上，没有流出
2）用10：40：50 的洗脱浓度，第一管回收率为55%-60%，第二管非常少，说明回收干净了，但为什么回收率只有一半了？
3）含55%氨水的甲醇溶液，洗脱回收的第一管也是55%-60%，第二管几乎没有，问题同上。
4）含70%/80%/90%氨水的甲醇溶液，甚至100%的氨水，回收的峰非常大，与其左右的峰相连，回收率可能有百分之几百。
是不是柱子本身就吸附部分精氨酸，洗不下来，要换个高点的浓度做做？正在试验中。。。。。
自己顶下，
换了25uM 的浓度，测了回收率是130%，真是不知道问题出哪了？
可不可以不用过柱回收，直接将样品如组织，血清，细胞等除去蛋白后直接吹干，做液相色谱。
我已经用组织的样品这样做过，4倍丙酮除去蛋白后，上清吹干，衍生，测定，结果精氨酸的峰与周围的峰分不开，各位可有好的洗脱条件或其它办法？？？？
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