各位大虾，我们第一次按05版中国药典做决明子药材含量测定时，竟然发现大黄酚对照品图谱出现多个峰（见下图1），我们用的中检所的大黄酚对照品，标明的是中药化学标准品，供含量测定使用的，批号是20061015。
对照品溶液我们用两瓶对照品分别配制过两次结果都一样，应该不会是污染造成的吧？而且对照品都是刚刚购买回新开启。需要用归一法进行计算吗？
请各位大虾指教！
色谱条件：C18柱，4.6mmX250mm；流动相:甲醇-0.1%磷酸溶液（85：15）；检测波长:254nm
图1：大黄酚对照品HPLC图谱
图2：决明子药材HPLC图谱
请问哪位同学能给我一些有关HPLC原理的资料？非常感谢！×××@126.com
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请勿留联系方式，谢谢合作！
－－lyslinjiu
我猜是：
1 Rt=3.15min的是溶剂峰，用配置样品的溶剂做空白对照，就能够看出来是否是溶剂峰。
2 你的Rt=9.38min的峰也是峰形不对称。柱子多用甲醇和10%甲醇冲洗，用流动相多平衡一段时间。如果是色谱柱混有杂质也能够除去。
关于对照品溶液图谱的峰（这种情况在中药分析中，还是偶尔会出现的）：
一般我们在做质量标准方法学研究时，都要求配制对照品溶液时尽量用与流动相的溶液，这样做的好处是减少/消除了图谱上的溶剂峰，同时色谱纯的流动相也减少了杂质峰出现的可能。
但多数情况并不是我们在研究方法，而是在应用方法。如LZ给出的对照品溶液走出来的图谱，这个是有一定的代表性的（应用药典一部的方法，得不到理想的效果）。除去仪器所造成的影响因素，其主要诱因有，
1、5分钟之前出现的峰，为溶剂产生的色谱吸收峰。溶解对照品、样品的溶剂，在分析过程中几乎无保留，于色谱柱内首先洗脱下来，由于其与流动相的差别，会出现正吸收/负吸收，所以在5分钟以前出的色谱峰一般较大（溶剂的量要大于待测物质本身），有时会出现倒峰，在分析过程中无意义。
2.由于使用不同于流动相的溶液来溶解对照品/样品，如LZ的决明子药材测定，采用无水乙醇-乙酸乙酯（２：１），由于一些实验室条件的限制，可能像乙酸乙酯这样的溶剂不会购买色谱级别的，而分析纯的标准要求又不是很高，一些杂质可能会产生一些保留＋吸收（像决明子这样的色谱条件，在２５４nm这个多数物质都有吸收的波长下进行测定，产生杂质吸收的可能性就更大了）。
3.除去对照品保存过程中产生的降解/转化，一般的对照品，即使是中检所购买的，也不能达到100%的纯度，杂质的存在是必然的（没有绝对纯净的东西，这个哲学上可以来解释），物质经过纯化也会带入些许杂质（但是对照品本身是满足其达到的百分含量的要求的），这部分难纯化的杂质又多是和对照品本身化学结构相似的物质，它们与对照物质有着相似的色谱保留，有着相似的色谱吸收条件，对于色谱图中5分钟之后的细小的吸收峰，多是这部分杂质产生的。只要保证色谱系统正常，对照品质量正常，且严格执行质量标准，分析过程无疑问点的话，这部分吸收峰也是可以忽略不计的。
顺便多说几句，对于药典标准这个法定标准，有时确实让人爱恨交织。看一下LZ得到的药材图谱就会发现，其方法中药材的前处理是如此的简单，以致大量的杂质大摇大摆走过了色谱柱，同时肯定或多或少再经过的色谱路径上留下了他们的“脚印”。这个也不是药典的错，虽然是05版药典，但是多数人都知道，这部分质量标准的制定是在00-05年之间完成的，标准的制定人员所在实验室条件也可能差异很大，且相对于现在来说，当时也是在相对落后的仪器上来完成质量标准的制定，所以很多时候我们都得不到很好的色谱图谱。
对于这样的结果，我们虽不能擅自更改前处理方法这样的硬性指标，但在现有的基础上，稍微调整流动相比例，以求达到更好的分离效果和更高的理论塔板数还是可能的，并且也不影响最终的测定结果。
1.以我们做HPLC的经验，第一个峰附近的应该是杂质峰，我建议把流动相的比例降低一些，也许就能够分开了
2。磷酸的量可以加大一点，我们之前做液相，用的是0.4%的，峰拖尾很严重，但是把增加到0.6%，峰形就恨漂亮了，而且分离度和理论塔板数都有很大的提高！
3.这两种改变都会使出峰时间延迟，建议把分析时间延长一点，避免峰在分析时间内出不来！
这根柱子不行了。这样的流动相跑出来峰型都不对称。还有就是用混合溶剂溶解也带来一定的影响。
对照品开封后若没有被污染的话，很可能是对照品本身的问题。但是有些溶剂也会因有UV而出峰，这种情况要去做空白排除。
这根柱子不行，建议换柱子。并调整流动相比例，推迟出峰时间
对照品溶液我们用两瓶对照品分别配制过两次结果都一样，应该不会是污染造成的吧？而且对照品都是刚刚购买回新开启。需要用归一法进行计算吗？
请各位大虾指教！
色谱条件：C18柱，4.6mmX250mm；流动相:甲醇-0.1%磷酸溶液（85：15）；检测波长:254nm
图1：大黄酚对照品HPLC图谱
图2：决明子药材HPLC图谱
请问哪位同学能给我一些有关HPLC原理的资料？非常感谢！×××@126.com
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我猜是：
1 Rt=3.15min的是溶剂峰，用配置样品的溶剂做空白对照，就能够看出来是否是溶剂峰。
2 你的Rt=9.38min的峰也是峰形不对称。柱子多用甲醇和10%甲醇冲洗，用流动相多平衡一段时间。如果是色谱柱混有杂质也能够除去。
关于对照品溶液图谱的峰（这种情况在中药分析中，还是偶尔会出现的）：
一般我们在做质量标准方法学研究时，都要求配制对照品溶液时尽量用与流动相的溶液，这样做的好处是减少/消除了图谱上的溶剂峰，同时色谱纯的流动相也减少了杂质峰出现的可能。
但多数情况并不是我们在研究方法，而是在应用方法。如LZ给出的对照品溶液走出来的图谱，这个是有一定的代表性的（应用药典一部的方法，得不到理想的效果）。除去仪器所造成的影响因素，其主要诱因有，
1、5分钟之前出现的峰，为溶剂产生的色谱吸收峰。溶解对照品、样品的溶剂，在分析过程中几乎无保留，于色谱柱内首先洗脱下来，由于其与流动相的差别，会出现正吸收/负吸收，所以在5分钟以前出的色谱峰一般较大（溶剂的量要大于待测物质本身），有时会出现倒峰，在分析过程中无意义。
2.由于使用不同于流动相的溶液来溶解对照品/样品，如LZ的决明子药材测定，采用无水乙醇-乙酸乙酯（２：１），由于一些实验室条件的限制，可能像乙酸乙酯这样的溶剂不会购买色谱级别的，而分析纯的标准要求又不是很高，一些杂质可能会产生一些保留＋吸收（像决明子这样的色谱条件，在２５４nm这个多数物质都有吸收的波长下进行测定，产生杂质吸收的可能性就更大了）。
3.除去对照品保存过程中产生的降解/转化，一般的对照品，即使是中检所购买的，也不能达到100%的纯度，杂质的存在是必然的（没有绝对纯净的东西，这个哲学上可以来解释），物质经过纯化也会带入些许杂质（但是对照品本身是满足其达到的百分含量的要求的），这部分难纯化的杂质又多是和对照品本身化学结构相似的物质，它们与对照物质有着相似的色谱保留，有着相似的色谱吸收条件，对于色谱图中5分钟之后的细小的吸收峰，多是这部分杂质产生的。只要保证色谱系统正常，对照品质量正常，且严格执行质量标准，分析过程无疑问点的话，这部分吸收峰也是可以忽略不计的。
顺便多说几句，对于药典标准这个法定标准，有时确实让人爱恨交织。看一下LZ得到的药材图谱就会发现，其方法中药材的前处理是如此的简单，以致大量的杂质大摇大摆走过了色谱柱，同时肯定或多或少再经过的色谱路径上留下了他们的“脚印”。这个也不是药典的错，虽然是05版药典，但是多数人都知道，这部分质量标准的制定是在00-05年之间完成的，标准的制定人员所在实验室条件也可能差异很大，且相对于现在来说，当时也是在相对落后的仪器上来完成质量标准的制定，所以很多时候我们都得不到很好的色谱图谱。
对于这样的结果，我们虽不能擅自更改前处理方法这样的硬性指标，但在现有的基础上，稍微调整流动相比例，以求达到更好的分离效果和更高的理论塔板数还是可能的，并且也不影响最终的测定结果。
1.以我们做HPLC的经验，第一个峰附近的应该是杂质峰，我建议把流动相的比例降低一些，也许就能够分开了
2。磷酸的量可以加大一点，我们之前做液相，用的是0.4%的，峰拖尾很严重，但是把增加到0.6%，峰形就恨漂亮了，而且分离度和理论塔板数都有很大的提高！
3.这两种改变都会使出峰时间延迟，建议把分析时间延长一点，避免峰在分析时间内出不来！
这根柱子不行了。这样的流动相跑出来峰型都不对称。还有就是用混合溶剂溶解也带来一定的影响。
对照品开封后若没有被污染的话，很可能是对照品本身的问题。但是有些溶剂也会因有UV而出峰，这种情况要去做空白排除。
这根柱子不行，建议换柱子。并调整流动相比例，推迟出峰时间