大分子药物主要包括酶、细胞因子等一些具有特殊功能的蛋白质，作用专一、高效，对人体健康有重要作用。过去，多肽和蛋白质只能从天然物质中提纯获得，随着基因工程的发展，这个障碍已基本克服。但此类药物稳定性差、血浆半衰期短、具有免疫原性，使其在生产和应用方面受到极大限制。

　　1970年代末人们用聚乙二醇(PEG)修饰牛肝过氧化氢酶，改善其免疫原性和循环时间。1991年PEG修饰的腺苷脱氨酶面市后，已陆续有PEG修饰的门冬酰胺酶、干扰素-a-2a和2b经FDA批准用于临床。

　　目前，PEG修饰技术正成为大分子药物传递系统研究的热点之一。

　　采用PEG进行结构修饰可改善药物的以下性质：(1)增加稳定性：(2)改善药动学性质：(3)降低免疫原性；(4)降低毒性，提高体内活性；(5)改善体内分布。

1 PEG修饰的条件
　　
　　1．1 药物的活性反应官能团

　　PEG与多肽或蛋白质的修饰反应属于亲核反应。大分子药物C端的a-COOH、N端的a-NH2及赖氨酸(Lys)、门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、色氨

酸(Try)、甲硫氨酸(Met)、组氨酸(His)等9种氨基酸的侧链在一定的介质环境中较易离子化而呈现亲核性，亲核活性由大到小依次为：R-S->R-NH2>R-COO-=R-O-。Cys的巯基是最易被修饰的氨基酸残基，但Cys在蛋白质中的总量很少，通常位于蛋白质的二硫键和活性中心。Lys占蛋白质中所有氨基酸总量的10％，且较少参与构成多肽或蛋白质的活性中心。因此，目前PEG通常修饰的位点是大分子表面Lys残基上的氨基，包括a-NH2或ε-NH2。Ballon等对干扰素-a-2a进行PEG修饰，结果表明94％的修饰位点都集中在干扰素的Lys31、Lys121、Lys131、Lys1344个残基上，其余6％位于Lys70和Lys83。若PEG与位于蛋白质活性中心的Lys残基连接，必然会影响生物活性，此时可选择带有羧基侧链的氰基酸残基为修饰位点，但必须考虑到氨基酸自身的交联反应。在糖蛋白中糖基上也有一些修饰位点．如还原性的末端醛基、羟基等，存一些特殊情况下还包括伯氨基、羧基、磷酸基。此外，糖的邻羟基较易被高碘酸氧化形成具有反应活性的缩甲醛基。
　　1．2 活化的PEG修饰剂

　　 PEG末端的醇羟基化学性质不活泼，为保证其与药物活性基团间有适宜的反应速率，需对醇羟基进行活化，以利于与蛋白质的a-和ε-氨基的反应。

　　 按PEG与蛋白质氨基形成的连接键类型，活化PEG可分为以下两大类：

　　 (1)烷基化PEG(alkylating PEGs，通过烷基键连接)，如醛基化PEG(PEG aldehyde)、PEG-三氟乙基磺酸酯(2．2，2-trifluoroethanesulfonyl，PEG-T)和环氧烷基化PEG(PEG epoxide)。醛基化PEG可通过氰基硼烷还原、与R-NH2形成Schiff氏碱得到，适于活性中心含有带正电荷的大分子药物。但反应速率较低，有时需反应24h，长时间的反应有可能使不稳定的蛋白质失活，pH对反应的选择性有重要影响，pH5左右时醛基化PEG只与a-NH2反应。
　　 PEG-T是另一种可保持含有正电荷活性中心蛋白质活性的PEG修饰剂，但反应专属性不强、定性困难，环氧烷基化PEG的反应速度也较慢，且其开环生成的羟基有可能与蛋白质发生副反应。

　　 （2）酰化PEG(acylating PEGs,通过酰胺键连接)，其中大多是羧酸化PEG与N-羟基琥珀亚胺(hydroxysuccimidc)所形成的活性酯(PEG-O-X-COOSu)，目前较常用的是PEG琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(PEG-succhnimidyl succinate，PEG-SS)和PEG琥珀酰亚胺基碳酸酯(PEG-succinimidyl carbonate，PEG-SC)。研究表明，-COOSu基团与PEG连接的最后一个烷氧基长度对其与氨基或水的反应活性有显著影响，如PEG-O-CH2-CH2-CH2-COOSu的水解半衰期为23h，而PEG-O-CH2-COOSu仅为0.75h。此外，用氯甲酸酯活化的PEG与用琥珀酰亚胺活化的PEG相比，修饰反应速率低，可控性强，修饰可具有一定的选择性；在水相-有机相体系中的反应也较容易。
2 修饰度的测定方法

　　多肽或蛋白质的修饰度指每个修饰产物上偶联的PEG分子数。可通过三硝基苯磺酸法、铁氰酸胺法、荧光胺法测定未被修饰的氨基酸残基的量，而间接得到蛋白质的修饰度。但干扰因素较多，灵敏度较低。目前常用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱 (matrix-assisted laser desorption ionization time of flight masss pectrometry，MALDI-TOF-MS)分离和检测。通过得到的分子离子峰及所用修饰剂的分子量，就可确定不同产物的修饰度。但由于仪器昂贵、样品需前处理，使其应用也受到了一定的限制。Sartore等提出了一种根据氨基酸测定多肽或蛋白质修饰度的方法。正亮氨酸(Nle)是很少在多肽或蛋白质中出现的氨基酸，所以可先合成PEG-Nle-OSu，用其修饰蛋白质，再用盐酸水解，通过测定Nle的含量可计算得出修饰度。

3 修饰后药物性质的变化

　　 3．1 稳定性增强

　　某些物理和化学因素会改变或破坏蛋白质分子的空间构象，导致其生物活性的丧失和一些理化性质的改变。亲水性PEG与蛋白质共价结合后，可使蛋白质颗粒表面形成较厚的水化层，阻止其凝集、沉淀。此外，PEG的柔性链可通过空间位阻作用保护蛋白质中易受各种蛋白酶攻击的区域。
　　文献采用加速振摇试验评价了未经修饰和采用不同分子量的单甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰的胰岛素的物理稳定性，以保留50%起始浓度的时间为表示样品物理稳定性的相关值。结果表明，mPEG与胰岛素的苯丙氨酸B1位点共价结合产物的物理稳定性比未修饰的胰岛素高36—40倍，且其稳定性随着mPEG分子量的增大而延长。Croyle等分别用氰尿酰氯(cyanuric chloride)活化的mPEG、PEG-SS和PEG-T，对腺病毒进行修饰，置-20、4、25、42℃的磷酸钾缓冲液(pH7．4)中，进行为期6个月的物理稳定性考察。结果表明，在各试验条件下，经mPEG修饰的腺病毒的物理稳定性显著高于未修饰的病毒，其中后两种活化mPEG修饰的腺病毒在室温下24h内的效价几乎无损失，有利于腺病毒作为病毒载体的使用。Soares等分别考察了用分子量为5000的PEG-SS修饰的门冬酰胺酶(PEG-L-asparaginase)对酸、热、酶的稳定性。结果表明，经PEG修饰后，门冬酰胺酶的稳定性显著提高。
　　 SDS-聚内烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示，pH3．5下PEG-L-门冬酰胺酶在1h内未发生变性，保持稳定。将其置65℃、pH6．8的50mmol/L Tris-HCl溶液小，1h后生物活性仍可保留32％。在体外人血清培养试验中，其生物活性40min内无改变。

　　 3．2 药物动力学性质改善

　　经PEG修饰后，许多蛋白质在体内的药物动力学性质都发生了显著改变，血浆半衰期明显延长，肾清除率显著降低。目前认为这种变化主要是基于以下3点：(1)许多经静脉给药的蛋白质很快被网状内皮组织(RES)。肾、肝、脾消除，这种消除依赖于蛋白质分子的大小、电荷及与特定细胞内受体的亲和力，而用PEG修饰后，上述性质均发生了改变：（2）蛋白质易被体内的蛋白水解酶代谢，半衰期和滞留时间较短，PEG可利用空间位阻作用减少受水解酶攻击的几率，从而减少降解：(3)药用的非人源性蛋白质都具有一定的免疫原性，进入体内后易被免疫系统消除，PEG的空间位阻作用可掩蔽蛋白质上的抗原决定簇，从而减少被免疫系统清除的几率。
　　Pepinsky等采用分子量为20000的乙醛化PEG对重组人干扰素-β-1α进行修饰，并以猴、大鼠、小鼠为模型动物，静脉或皮下注射给药，考察其体内药动学性质。在所有模型中，血浆半衰期平均增加5倍，清除率为原先的1／10，分布体积明显减小，可推断干扰素经PEG修饰后减少了在血管外的分布。Cohen等分别考察了用分子量为5000和20000的PEG修饰的重组人乙酰胆碱酯酶(rHuAChE)在小鼠体内的药动学行为。结果表明，PEG 20000-rHuAChE(4：1)组的平均滞留时间(MRr)是未经修饰的rHuAChE的50倍，这种显著的改变可能取决于连接到酶上的PEG分子的大小和个数。此外，PEG-rHuAChE的表观分子量与其在体内的MRT有一定的线性关系。LI等采用分子量为5000、12000、20000的PEG—SS修饰重组人肿瘤坏死因子-O(rHuTNF—α)。结果表明，其在小鼠体内的半衰期均显著延长，其中PEG20000-rHuTNF-α的半衰期(24．8h)是未修饰(28．8min)的50倍。Trakas等采用马来酰亚胺化PEG(PEG—maleimide)为修饰剂，制备了带有2个鼠源性抗乙酰胆碱受体(AchR)主要免疫原性区域(main immunogentic region，MIR)的单克隆抗体Fab片段。大鼠体内的药动学试验表明。未经PEG修饰的Fab片段在3—6h内很快被清除；而修饰后半衰期则显著延长至30h左右，与AchR的结合能力未发生显著改变，而免疫原性则显著降低。

　　 3．3 免疫原性降低

　　现在临床上使用的蛋白质类药物大多是非人源性的，重复给药后会在一定程度上诱导机体产生免疫反应．从而影响疗效。用PEG修饰能掩蔽蛋白质表面的抗原决定簇，降低免疫原性。
　　文献采用酶联免疫吸附试验(ELISA)评价了4种PEG修饰的胰岛素在小鼠体内的免疫原性和抗原性。结果表明，PEG修饰的胰岛素与抗IgG抗体的结合能力显著下降，mPEG的分子量为2000时。修饰物的免疫原性几乎不存在：这为解决胰岛素使用中出现的诱导机体产生变态反应和抗体介导的内源性胰岛素分泌抑制等问题提供了良好的解决途径。张全等采用mPEG修饰脐血淋巴细胞，并观察修饰后对淋巴细胞表面某些抗原的遮蔽作用及造血T祖细胞体外集落形成能力的影响。结果表明，修饰后细胞表面的CD3、CD4和CD8抗原的相对荧光强度明显下降，mPEG的浓度越大，遮蔽效果越好。体外人干细胞培养试验表明，用不同浓度mPEG修饰的淋巴细胞组培养，形成的粒细胞--巨噬细胞集落形成单位(colonyforming unit-granu ocyte macrophage，CFU-GM)数量与对照组无显著性差异，说明mPEG修饰后几乎可完全遮蔽其表面抗原，但不影响干／祖细胞在体外的增殖、分化能力。He等在天花粉(trichosanthin，TCS)的PEG定位修饰研究中，采用聚合酶链反应制备了S7C、0219C、K173C和首先制备了一种重组的免疫毒素，该免疫毒素由两部分组成：抗人Tac单克隆抗体的单链Fv片断和一段38kD的假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin，PE)片断。然后对其进行PEG定位修饰。结果表明，修饰后的药物在小鼠体内的毒性明显降低，PEG-LMB-2的LD50（3.0mg／kg）是LMB-2的(0．5mg／kg)的6倍。此外，PEG-LMB-2在荷Tac-4肿瘤的小鼠体内的抗肿瘤活性是LMB-2的3倍。Eliason等制备了PEG修饰的重组人粒细胞集落刺激因子(rHuG-CSF)，考察其在狝猴体内的药物活性。结果表明，修饰后药物的体内活性显著增加，其中PEG20000-rHuG-CSF单剂量肌注6d后，血中嗜中性粒细胞水平与rHuG—CSF连续注射6d相当。Matousek等以荷黑色素瘤的无胸腺裸鼠为动物模型。研究经PEG修饰的牛胰核糖核酸酶(bovine pancreatic rihonuclease，RNnse A)和牛精液核糖核酸酶(hovine seminal ribonuclease，BS-RNase)在裸鼠体内的抗肿瘤活性：结果表明，未经修怖时。RNase A对肿瘤的生长没有实质性的抑制作用，而BS-RNase则具有较高的抗肿瘤活性，用PEG修饰后，RNase A的抗肿瘤活性明显提高，与BS-Rnase的活性相近。但修饰后两者的免疫原性基本不变。

　　 3.5 体内分布改善

　　 由于大多数大分子药物的分子量在10000-30000内，全身给药后能通过肾小球滤去。与PEG结合后，分子量增大，可防止其从肾小小球毛细血管中渗出。减少在尿中的排泄量。同时，用PEG修饰后可提高大分子药物在体循环中的稳定性。延长在体循环中的滞留时间，有益于改善药物的体内分布尤其有利于大分子药物在具有渗透和滞留增强效应(enhanced permeability and retention effect，EPR)的肿瘤以及炎症部位的蓄积。
　　鲑降钙素(salmon calcitonin，sCT)在肾赃中迅速代谢为无活性的小片段，占体内总代谢的2／3。Yoo等用分子量为5000的mPEG-SC修饰sCT，采用氯胺T法标记PEG-sCT和未经修饰的sCT，考察其在大鼠体内的分布。结果表明，单—和二—PEG-sCT(分别表示sCT上连接了1种和2种PEG)在肾脏中的分布明显比未经修饰的sCT低，二—PEG—sCT在肝脏和脾脏中的分布也显著减少。二-PEG-sCT与sCT的消除半衰期分别为(107．2±32．8)和(59．8±45．2)min，稳态分布体积(Vss)分别为(229．9±68．3)和(603．1±332．3)ml／kg。Caliceti等制备了PEG修饰的蛋清抗生物素蛋白(egg white avidin)，考察了其在荷Erlieh实体瘤小鼠体内的分布。结果表明，PEG修饰后药物在肝、肾中的分布显著减少，其中用PEG20000修饰的药物在小鼠尾静脉给药15min后，肝和肾中的分布仅为原药的1／8～1／7：在肿瘤组织中的分布明显增加，用分子量5000、10000、20000的PEG修饰的药物在肿瘤中的分布量分别是4％、5％和8％，其中用PEG20000修饰的在肿瘤中的高蓄积浓度(>6％)可维持72h。Li等考察了未修饰和用PEG修饰的rHuTNF-a在荷S—180实体瘤小鼠体内的分布．结果显示，给药后6h，后者在血液和肿瘤组织中的蓄积量明显大于前者，其中PEG20000-rHuTNF-α在肿瘤组织的分布量为前者的5倍。

4 存在的问题与解决思路

　　4．1对蛋白质活性位点的保护

　　 PEG可防止蛋白水解酶或抗体对多肽或蛋白质某些片段的攻击，保持大分子药物的稳定性，但这也可能阻止底物与蛋白质活性中心的位点结合，从而影响被修饰蛋白的生物活性或与受体结合的能力。这一缺点大大制约了PEG修饰技术在大分子药物中的应用，目前各因研究者正在设法解决定一问题。

　　　　4．1．1 引入可逆的位点深护基因
　　　　 可选用一些对于蛋白质活性位点有特殊亲和力的底物、抑制剂等，在PEG修饰反应前对活性位点进行保护，修饰后再脱去保护基团。Calicei等首先将胰蛋白酶(trypsin)抑制剂苯甲脒(benzamidine)共价结合到琼脂糖凝胶树脂上，在适宜的pH和离子强度下，与胰蛋白酶的活性位点结合，再进行PEG修饰反应，最后通过改变pH将修饰产物从树脂上洗脱下来；作者比较了PEG修饰前经苯甲脒保护和未保护的胰蛋白酶的水解活性。结果表明，分别以酪蛋白和牛血清白蛋白为底物时，前者的活性为95％和45%，而后者为28％和0。unoda等采用可逆的氨基酸保护剂二甲基马来酐(dimethylmalcic anhydride，DMMAN)在PEG修饰前对肿瘤坏死因子-a(TNR-a)进行保护，结果显示经DMlVLAN保护的PEG-TNF在雌性小鼠体内抗Meth-A纤维素肉瘤的活性是未保护的PEG-TNF的2倍。

　　　　4．1．2 选择合适的PEG类型
　　　　 目前采用的PEG修饰剂主要有线形和分枝状两大类。分枝状PEG由于其空间位阻效应，只能与易接近的氨基酸残基反应，因此可较大程度地保留蛋白质的生物活性。Veronese等采用PEG欠量的修饰反应，结果只得到了在12、21位单PEG修饰的异构体，其中的一个修饰产物经证实具有较高的生物活性。

　　　　4．1．4定位修饰技术
　　　　利用不同氨基酸残基反应活性的差异，控制反应条件使修饰反应只发生在某些氨基酸残基上。Cys中巯基的亲核活性最强，通过蛋白重组技术可在蛋白的非活性区域引入Cys，可使大部分修饰反应都集中在该氨基酸上，从而起到保护活性中心的作用。Goodson等通过重组技术把Cys残基引入白介素(rIL-2)的非活性单糖基化位点，采用马来酰亚胺活化的PEG(PEG-maleimide)对其进行修饰。结果表明，PEG—Cys-rIL-2与IL-2具有几乎相同的生物活性，而前者在体循环中的滞留时间是后者的4倍。

　　4．2聚乙二醇的原料质量

　　 在修饰反应前，需先对PEG末端的醇羟基进行活化。为避免在修饰过程中发生交联和团聚，常采用mPEG作为修饰剂的合成原料。不同的聚合工艺和不同来源的mPEG的分散性不同，mPEG的分散性高，修饰物的均一件难以保证。因此，建议先通过质谱或凝胶过滤色谱分析确定出不同来源的mPEG聚合物的分布宽度指数MdM．的值，据此选购mPEG原料。另外，由于聚合过程中少量水的存在，mPEG产品中有1％一15％的PEG--醇(OH-PEG-PEG-OH)杂质。其含量取决于mPEG的分子量，分子量越小，二醇的含量越低。二：醇在mPEG的活化过程中会产生交联或团聚。若mPEG产品中存在二醇，凝胶过滤色谱图谱上就会出现—个位于主峰前的小峰，分子量恰好是mPEG的2倍：通过峰面积可确定相应的二酵含量。

5 结语

　　 PEG修饰技术近年来发展较快，除用于修饰多肽和蛋白质以外，也用于核酸、脂质体、纳米粒等的修饰。随着新的修饰剂和修饰技术的研究，将会极大地促进大分子药物的临床应用
没人响应 自己顶一个先