在进行HPLC分析之前，需要对样品进行制备。样品制备的目的是将样品中的目标化合物从复杂的基质中分离出来，以便进行后续的分离和检测。样品制备的方法包括萃取、净化、浓缩等。在样品制备过程中，需要注意避免样品的污染和损失，以保证分析结果的准确性和可靠性。
1.将已经过滤并脱气的流动相注入储液罐；（过滤：0.45um或更小孔径滤膜，目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液时。脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡，一般500ml溶液需超声20至30min方可）
2. 用流动相冲洗金属过滤器（瓶子里的过滤头），然后将过滤器浸入储液罐的流动相中；
3. 将储液罐放置在一定的高度，以避免由于搬运和其他操作人员的移动而造成不必要的跌落。
4. 然后按以下顺序依次启动高效液相色谱仪：泵→检测器→高效液相色谱软件→按预先计划的方法设置软件参数，如分析时间、检测波长、流速等。
启动泵（LC-20AT）之后，可以手动清洗管路，方法是打开排液阀，旋转180度，然后点左边的purge，可以多清洗几遍，一直到A管中看不到明显气泡。
清洗的时候如果提示错误，先检测是不是管路有太多气泡（尤其是A管路中可能由于长期放在纯水中，长菌，不停形成气泡，在线脱气无用，要用异丙醇清洗瓶中过滤头），如果是提示leak之类的，就是有漏水，看看哪里漏，拆开重新扭紧，然后清理泵右下角的检测器，有一块铁片挡着，要用螺丝批拆开，用纸吸干水
高效液相色谱软件：就是电脑上的LabSolutions，然后软件中选泵LC-20AT，点击打开即可
方法最好自己新建一个，流速什么的根据论文，一般是1ml/min，最大泵压力一般是20MPa，检测波长有2个，可以同时检测两个东西，分析时间如果不知道可以设置长一点，如60min，到时候可以手工停止
自动排气，A路肯定要排（水，清洗用的，或者和其他溶剂按比例混合用），其他管路用到才需要排，如用到C管路就排C管路的，一般5min即可
5. 启动泵（点仪器ON或工作站泵图标上面的泵on），运行5分钟，主要是为了排除系统中的气泡，结束后关闭所有排气阀；
点自动排气，系统按照之前设置的自动排气方法对管路排气（就是对需要用到的管路），排气完成会自动停止，然后需要对进样针排气（这个可以和跑基线一起进行，因为基线一般要跑30min），点工作站自动进样器下面的按钮“排气”进行，这个不会自动停止，一般过了5分钟手动再点一次这个按钮停止。
6. 然后按照预先计划的速度，以固定的速率，如1mL/min左右，运行流动相，走基线，直到基线平稳，就可以在计算机软件上进行监视；
7. 基线平稳后(一般30min)，在软件中设置样品的运行参数，如流速和分析时间等(其实前面方法已经设置了的，如果需要改变，这个时候可以改)。分析时间会因样品、流速、柱长等因素变化。
8. 参数设置完毕后，将固定体积（看论文，一般是10ul）的样品溶液注入进样阀(这个是手工方法，实际上现在都是自动进行器)，然后在软件中启动注入命令，进样器中的样品溶液就随流动相进入色谱柱；
自动进样器的使用：在工作站里面点单次分析，可以填写样品名，数据文件保存位置和名称，还有样品在样品架的编号，哪个样品架（岛津有2个样品架，一个是长方形，可以放比较多样品的，是样品架1，一个是长条形，只能放1列的，是样品架2）
9. 通过软件监视各项读数，当检测器检测到样品所有峰值，停止运行并设置新的进样。在下一个样品分析前，建议留出5-10分钟，待流动相通过色谱柱，以便清洗之前样品的残留物；确认基线稳定后，进行下一次注射。
10. 分析结束后，要清洗柱子，先关闭检测器，然后关闭泵，最后关闭软件。
清洗反向柱子一般用甲醇
数据处理方法：
1建立定量分析方法
打开工作站选择仪器的界面，点左边“处理工具”，点右边的“在解析”，如果没有助手栏和任务管理器，可以从菜单下面的按钮那里打开
然后在数据管理器里打开自己的数据保存的文件夹，然后把其中一个数据文件拖到右边打开
点击最左边助手栏里的“数据处理”里的“向导”，适当修改相关参数，然后下一步
选择自己需要的峰，然后下一步，定量方法一般是外标法，依据面积，校准点数就是你弄标曲要做几个样（几个浓度梯度，如4个），曲线类型一般为直线，下一步
修改时间窗（就是由于操作等因素导致峰稍微有点漂移所允许的时间范围），默认5%，下一步，
填入样品名称、类型参考、拉滚动条过去，填入标曲的浓度梯度的浓度（上面设置了4个这里要填4个），点完成
然后在右下角的方法视图那里点视图，
然后点左边助手栏里的“数据处理”里的“应用到方法”，弹出对话框，保存方法，最好放到自己的文件夹里，弹出对话框，默认即可，此时 定量分析方法建立完成
2校准（校准）曲线的建立
点左边助手栏的主项目，里面有“批处理再解释”，点击后，在数据管理器里点最下面的数据tab，然后把4个标准品（根据上面你的标曲浓度梯度的设定）的数据文件选中，拖到右边
确认样品名称和ID没有错，样品类型选择1标准，将标曲低浓度，也就是第一个点的文件类型选择为初始化标准曲线，这个时候文件类型后面会加个I，后面的方法为上面建立的定量分析方法，数据文件建议重新选择刚才那几个数据文件，级别号按照顺序1234填进去，然后点保存，按个名（如XXX标准曲线批处理方法）
然后点最左边助手栏里的“批处理再解释”里的“批处理再解释开始”，如果有错误，根据错误提示修改，比如可能会提示数据文件找不到之类的，那是因为上面一步没有重新选择数据文件。中间可能会提示关闭已经打开的数据文件，按照提示关闭即可。
3标准（校准）曲线的查看
打开一个数据文件，在中间下部的“结果视图”窗口的“校准曲线”tab中可以看到这个点的校准曲线，只有打开最大浓度点的数据文件，才能查看所有的点形成的标曲。
3.2 校准曲线的建立 - 岛津分析检测_哔哩哔哩_bilibili
1.将已经过滤并脱气的流动相注入储液罐；（过滤：0.45um或更小孔径滤膜，目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液时。脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡，一般500ml溶液需超声20至30min方可）
滤膜类型：
聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。
醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。
尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。
再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂。
气泡对测定的影响：
（1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积
（2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形
（3）检测器中的气泡产生基线波动
2. 用流动相冲洗金属过滤器（瓶子里的过滤头），然后将过滤器浸入储液罐的流动相中；
3. 将储液罐放置在一定的高度，以避免由于搬运和其他操作人员的移动而造成不必要的跌落。
4. 然后按以下顺序依次启动高效液相色谱仪：泵→检测器→高效液相色谱软件→按预先计划的方法设置软件参数，如分析时间、检测波长、流速等。
启动泵（LC-20AT）之后，可以手动清洗管路，方法是打开排液阀，旋转180度，然后点左边的purge，可以多清洗几遍，一直到A管中看不到明显气泡。
清洗的时候如果提示错误，先检测是不是管路有太多气泡（尤其是A管路中可能由于长期放在纯水中，长菌，不停形成气泡，在线脱气无用，要用异丙醇清洗瓶中过滤头），如果是提示leak之类的，就是有漏水，看看哪里漏，拆开重新扭紧，然后清理泵右下角的检测器，有一块铁片挡着，要用螺丝批拆开，用纸吸干水
高效液相色谱软件：就是电脑上的LabSolutions，然后软件中选泵LC-20AT，点击打开即可
方法最好自己新建一个，流速什么的根据论文，一般是1ml/min，最大泵压力一般是20MPa，检测波长有2个，可以同时检测两个东西，分析时间如果不知道可以设置长一点，如60min，到时候可以手工停止
自动排气，A路肯定要排（水，清洗用的，或者和其他溶剂按比例混合用），其他管路用到才需要排，如用到C管路就排C管路的，一般5min即可
5. 启动泵（点仪器ON或工作站泵图标上面的泵on），运行5分钟，主要是为了排除系统中的气泡，结束后关闭所有排气阀；
点自动排气，系统按照之前设置的自动排气方法对管路排气（就是对需要用到的管路），排气完成会自动停止，然后需要对进样针排气（这个可以和跑基线一起进行，因为基线一般要跑30min），点工作站自动进样器下面的按钮“排气”进行，这个不会自动停止，一般过了5分钟手动再点一次这个按钮停止。
6. 然后按照预先计划的速度，以固定的速率，如1mL/min左右，运行流动相，走基线，直到基线平稳，就可以在计算机软件上进行监视；
7. 基线平稳后(一般30min)，在软件中设置样品的运行参数，如流速和分析时间等(其实前面方法已经设置了的，如果需要改变，这个时候可以改)。分析时间会因样品、流速、柱长等因素变化。
8. 参数设置完毕后，将固定体积（看论文，一般是10ul）的样品溶液注入进样阀(这个是手工方法，实际上现在都是自动进行器)，然后在软件中启动注入命令，进样器中的样品溶液就随流动相进入色谱柱；
自动进样器的使用：在工作站里面点单次分析，可以填写样品名，数据文件保存位置和名称，还有样品在样品架的编号，哪个样品架（岛津有2个样品架，一个是长方形，可以放比较多样品的，是样品架1，一个是长条形，只能放1列的，是样品架2）
9. 通过软件监视各项读数，当检测器检测到样品所有峰值，停止运行并设置新的进样。在下一个样品分析前，建议留出5-10分钟，待流动相通过色谱柱，以便清洗之前样品的残留物；确认基线稳定后，进行下一次注射。
10. 分析结束后，要清洗柱子，先关闭检测器，然后关闭泵，最后关闭软件。
清洗反向柱子一般用甲醇
数据处理方法：
1建立定量分析方法
打开工作站选择仪器的界面，点左边“处理工具”，点右边的“在解析”，如果没有助手栏和任务管理器，可以从菜单下面的按钮那里打开
然后在数据管理器里打开自己的数据保存的文件夹，然后把其中一个数据文件拖到右边打开
点击最左边助手栏里的“数据处理”里的“向导”，适当修改相关参数，然后下一步
选择自己需要的峰，然后下一步，定量方法一般是外标法，依据面积，校准点数就是你弄标曲要做几个样（几个浓度梯度，如4个），曲线类型一般为直线，下一步
修改时间窗（就是由于操作等因素导致峰稍微有点漂移所允许的时间范围），默认5%，下一步，
填入样品名称、类型参考、拉滚动条过去，填入标曲的浓度梯度的浓度（上面设置了4个这里要填4个），点完成
然后在右下角的方法视图那里点视图，
然后点左边助手栏里的“数据处理”里的“应用到方法”，弹出对话框，保存方法，最好放到自己的文件夹里，弹出对话框，默认即可，此时 定量分析方法建立完成
2校准（校准）曲线的建立
点左边助手栏的主项目，里面有“批处理再解释”，点击后，在数据管理器里点最下面的数据tab，然后把4个标准品（根据上面你的标曲浓度梯度的设定）的数据文件选中，拖到右边
确认样品名称和ID没有错，样品类型选择1标准，将标曲低浓度，也就是第一个点的文件类型选择为初始化标准曲线，这个时候文件类型后面会加个I，后面的方法为上面建立的定量分析方法，数据文件建议重新选择刚才那几个数据文件，级别号按照顺序1234填进去，然后点保存，按个名（如XXX标准曲线批处理方法）
然后点最左边助手栏里的“批处理再解释”里的“批处理再解释开始”，如果有错误，根据错误提示修改，比如可能会提示数据文件找不到之类的，那是因为上面一步没有重新选择数据文件。中间可能会提示关闭已经打开的数据文件，按照提示关闭即可。
3标准（校准）曲线的查看
打开一个数据文件，在中间下部的“结果视图”窗口的“校准曲线”tab中可以看到这个点的校准曲线，只有打开最大浓度点的数据文件，才能查看所有的点形成的标曲。
3.2 校准曲线的建立 - 岛津分析检测_哔哩哔哩_bilibili