糖的结构测定
由于分子生物学和分析技术的高速发展,多糖的分离和结构测定也取得了很大进展,糖化学家们利用化学、物理和生物学手段对多糖分子结构和功能进行研究,而高新技术的发展使分析手段更快速、高效和灵敏。但化学分析法仍然是经典的方法。
1 酸水解法 酸水解是鉴定多糖的单糖组成常用的方法,现在酸水解法已实现完全自动化。对多糖进行部分的酸水解以了解多糖各个亚单位或片段的连接方式。
2 甲基化法 该法可以阐明单糖的连接方式(键型)、重复结构中某种单糖的数目、末端糖的性质及分支点的位置等。但该法不能解决多糖中单糖的连接顺序。水解后的甲基化单糖混合物可用层析法分离或制成挥发性衍生物通过气相色谱(GC)分析。据报道,已能测定1～5μg 的水平复杂碳水化合物的糖苷键。在该技术中,糖在全氧甲基之前先用硼氘化钠还原。在全甲基化前,含有糖醛酸的多糖通过一个阳离子交换树脂(H+型),使所有的羧基都转变成质子型,这样就有可能使含有糖醛酸的残基的多糖更完全地甲基化。
3 碘酸盐氧化法 多糖因具有邻二醇、邻三醇结构而易被过碘酸盐氧化开环。通过测定过碘酸盐的消耗、甲酸的生成和剩余糖的比较就可确定多糖中各种单糖的键型及其比例。
4 Smith 降解法 用稀酸在室温下对多元醇进行部分酸水解,可得到各种赤藓醇糖苷或丙三醇糖苷,研究这些单糖苷、二糖苷和寡糖苷的结构有助于阐明多糖中单糖的部分连接顺序和键型。
5 碱降解法 碱降解发生在与单糖的羟基或羧酸连接的酯上,多糖还原端的单糖被逐个剥落,用之可分析多糖的键型。
6 酶水解法 酶水解是多糖控制降解的另一种方法,它主要是根据特定的酶降解特定结构的多糖的特性以阐明多糖的部分结构。
7 免疫化学法 多糖是许多微生物免疫特异性的决定因子,根据多糖抗原与蛋白质抗体的特异性,只有一定结构的多糖才能与一定类型抗体的蛋白质作用,如果能制备对抗未知多糖的抗体,那么这种抗体可用来阐明未知多糖的相似结构。
8 物理分析法
(1)红外光谱(IR)法 在多糖结构分析上主要是确定吡喃糖的苷键构型及常规观察其他官能团。一般主要观察730～960cm-1范围,如对于α-吡喃糖,δC1-H 为845cm-1 , 而β-吡喃糖δC1-H为890cm-1。IR对于多糖上特殊基团的检测仍然有着重要的作用。
(2)GC法 GC分析多糖虽受到样品挥发性和热稳定性的限制,但GC是多糖结构分析不可缺少的工具,常用GC与HPLC结合来分析多糖水解后单糖的组成及比例。
(3)MS法 MS已成为解决与碳水化合物有关的结构问题的有力工具。MS在鉴定各种甲基衍生物的碎片、确定各种单糖残基的连接位置非常有用。近年来,由于电喷雾电离质谱(ESI-MS)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-MS) 和快原子轰击质谱(FAB-MS) 的出现,MS还可以测定糖链的相对分子质量及糖链的一级结构。ESI-MS 因其能形成多电荷离子,故能测量相对分子质量近10万的大分子。ESI-MS易与HPLC、毛细管电泳(CE)、超临界液相色谱(SFC) 等技术联用,大大提高了工作效率、灵敏度和精确度。ESI-MS与碰撞诱导解离(CID)联用可得到不同的碎片离子,由此可获知低于pmol．L -1的寡糖及其复合物的相对分子质量、连接顺序及分支等信息。MALDI-MS 也是一种类似ESI-MS 的软电离技术,与ESI-MS 一样,这种电离技术产生的分子离子稳定,不易裂解,极适合于测定生物大分子样品,且准确度极高。测定的相对分子质量与分子形状无关(与层析法和电泳法不同) ,所以很适合测定多糖的相对分子质量及大小分布。此外,MALDI方法不受样品中的无机盐缓冲液的影响,其灵敏度也是较高的。FAB 条件下,开裂总是优先发生在糖苷氧的末端,产生连续顺序降解失掉单糖单位的突出峰。不论是阴性的还是阳性的FAB-MS 都能记下来,使低聚糖结构的测定简易快速。利用FAB-MS可以分析多糖部分水解片段的结构和组成。
(4)NMR法 用NMR技术研究糖链结构的优点是不破坏样品,糖链的结构特征通过化学位移、偶合常数、积分面积、NOE 及弛豫时间等参数表达。早期NMR 主要用于解决多糖结构中苷键的构型及重复结构中单糖的数目,近年来,NMR 技术的发展为生物大分子的结构研究创造了良好的条件。1H-NMR 和13C-NMR 常规用于确定呈现在重复单元中不同糖数目的差向构型的测定,氨基和脱氧糖的存在,氧-乙酰基和其他非糖取代基的鉴别。在确定多糖的单糖组成方面,除了通过1H-NMR 和13C-NMR 化学位移信息外,还可用1H-1H COSY、1 H-13C COSY等二维谱;在去顶单糖的类型和构型方面,可用1H-1HDQFCOSY、RCT、TOCSY、HOHAHA 和HETCOR-HMQC确定。在确定单糖的连接位置和顺序时可用1H-NMR 方法。
(5) CE 法 CE 是近年发展起来的一种糖类分析方法。CE在多糖结构研究中主要用来测定多糖的相对分子质量(不同质量、不同电荷的分子电泳迁移性能不同)、多糖或寡糖的组成分析、纯度鉴定、结构归属及单糖差向异构体的分离。与寡糖的降解方法联用,通过确定寡糖降解片段的结构并根据结构优化原理还能实现寡糖的结构分析。还可对多糖酶解产物进行定量和定性分析。另外,CE-MS 联用可以对细胞水平的极微量多糖进行精确分析。需要说明的是,CE 法分析结果的重现性较差,在进样方法和定量分析方面需要在技术上进一步提高。
9 生物学方法 生物学方法主要是酶学方法,即利用各种特异性糖苷酶水解多糖分子得到寡糖片段,再与其他定性、定量方法联用推测多糖的结构。目前,较为先进的酶学方法是试剂阵列分析方法(RAAM) ,由Edge 等创立。它是利用一系列特定的外切糖苷酶的混合物对多糖或寡糖进行酶解,将酶解所得的片段分离,并通过其流体力学体积与计算机数据库中的数据进行比较,从而大大提高了多糖结构分析速度和精度。另外,还有一种类似固相蛋白测序的技术,它首先将多糖或寡糖固定在一个固定载体上,再依次用糖苷酶作用,对每一种外切酶酶解下来的单糖进行定性、定量分析。
由于分子生物学和分析技术的高速发展,多糖的分离和结构测定也取得了很大进展,糖化学家们利用化学、物理和生物学手段对多糖分子结构和功能进行研究,而高新技术的发展使分析手段更快速、高效和灵敏。但化学分析法仍然是经典的方法。
1 酸水解法 酸水解是鉴定多糖的单糖组成常用的方法,现在酸水解法已实现完全自动化。对多糖进行部分的酸水解以了解多糖各个亚单位或片段的连接方式。
2 甲基化法 该法可以阐明单糖的连接方式(键型)、重复结构中某种单糖的数目、末端糖的性质及分支点的位置等。但该法不能解决多糖中单糖的连接顺序。水解后的甲基化单糖混合物可用层析法分离或制成挥发性衍生物通过气相色谱(GC)分析。据报道,已能测定1～5μg 的水平复杂碳水化合物的糖苷键。在该技术中,糖在全氧甲基之前先用硼氘化钠还原。在全甲基化前,含有糖醛酸的多糖通过一个阳离子交换树脂(H+型),使所有的羧基都转变成质子型,这样就有可能使含有糖醛酸的残基的多糖更完全地甲基化。
3 碘酸盐氧化法 多糖因具有邻二醇、邻三醇结构而易被过碘酸盐氧化开环。通过测定过碘酸盐的消耗、甲酸的生成和剩余糖的比较就可确定多糖中各种单糖的键型及其比例。
4 Smith 降解法 用稀酸在室温下对多元醇进行部分酸水解,可得到各种赤藓醇糖苷或丙三醇糖苷,研究这些单糖苷、二糖苷和寡糖苷的结构有助于阐明多糖中单糖的部分连接顺序和键型。
5 碱降解法 碱降解发生在与单糖的羟基或羧酸连接的酯上,多糖还原端的单糖被逐个剥落,用之可分析多糖的键型。
6 酶水解法 酶水解是多糖控制降解的另一种方法,它主要是根据特定的酶降解特定结构的多糖的特性以阐明多糖的部分结构。
7 免疫化学法 多糖是许多微生物免疫特异性的决定因子,根据多糖抗原与蛋白质抗体的特异性,只有一定结构的多糖才能与一定类型抗体的蛋白质作用,如果能制备对抗未知多糖的抗体,那么这种抗体可用来阐明未知多糖的相似结构。
8 物理分析法
(1)红外光谱(IR)法 在多糖结构分析上主要是确定吡喃糖的苷键构型及常规观察其他官能团。一般主要观察730～960cm-1范围,如对于α-吡喃糖,δC1-H 为845cm-1 , 而β-吡喃糖δC1-H为890cm-1。IR对于多糖上特殊基团的检测仍然有着重要的作用。
(2)GC法 GC分析多糖虽受到样品挥发性和热稳定性的限制,但GC是多糖结构分析不可缺少的工具,常用GC与HPLC结合来分析多糖水解后单糖的组成及比例。
(3)MS法 MS已成为解决与碳水化合物有关的结构问题的有力工具。MS在鉴定各种甲基衍生物的碎片、确定各种单糖残基的连接位置非常有用。近年来,由于电喷雾电离质谱(ESI-MS)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-MS) 和快原子轰击质谱(FAB-MS) 的出现,MS还可以测定糖链的相对分子质量及糖链的一级结构。ESI-MS 因其能形成多电荷离子,故能测量相对分子质量近10万的大分子。ESI-MS易与HPLC、毛细管电泳(CE)、超临界液相色谱(SFC) 等技术联用,大大提高了工作效率、灵敏度和精确度。ESI-MS与碰撞诱导解离(CID)联用可得到不同的碎片离子,由此可获知低于pmol．L -1的寡糖及其复合物的相对分子质量、连接顺序及分支等信息。MALDI-MS 也是一种类似ESI-MS 的软电离技术,与ESI-MS 一样,这种电离技术产生的分子离子稳定,不易裂解,极适合于测定生物大分子样品,且准确度极高。测定的相对分子质量与分子形状无关(与层析法和电泳法不同) ,所以很适合测定多糖的相对分子质量及大小分布。此外,MALDI方法不受样品中的无机盐缓冲液的影响,其灵敏度也是较高的。FAB 条件下,开裂总是优先发生在糖苷氧的末端,产生连续顺序降解失掉单糖单位的突出峰。不论是阴性的还是阳性的FAB-MS 都能记下来,使低聚糖结构的测定简易快速。利用FAB-MS可以分析多糖部分水解片段的结构和组成。
(4)NMR法 用NMR技术研究糖链结构的优点是不破坏样品,糖链的结构特征通过化学位移、偶合常数、积分面积、NOE 及弛豫时间等参数表达。早期NMR 主要用于解决多糖结构中苷键的构型及重复结构中单糖的数目,近年来,NMR 技术的发展为生物大分子的结构研究创造了良好的条件。1H-NMR 和13C-NMR 常规用于确定呈现在重复单元中不同糖数目的差向构型的测定,氨基和脱氧糖的存在,氧-乙酰基和其他非糖取代基的鉴别。在确定多糖的单糖组成方面,除了通过1H-NMR 和13C-NMR 化学位移信息外,还可用1H-1H COSY、1 H-13C COSY等二维谱;在去顶单糖的类型和构型方面,可用1H-1HDQFCOSY、RCT、TOCSY、HOHAHA 和HETCOR-HMQC确定。在确定单糖的连接位置和顺序时可用1H-NMR 方法。
(5) CE 法 CE 是近年发展起来的一种糖类分析方法。CE在多糖结构研究中主要用来测定多糖的相对分子质量(不同质量、不同电荷的分子电泳迁移性能不同)、多糖或寡糖的组成分析、纯度鉴定、结构归属及单糖差向异构体的分离。与寡糖的降解方法联用,通过确定寡糖降解片段的结构并根据结构优化原理还能实现寡糖的结构分析。还可对多糖酶解产物进行定量和定性分析。另外,CE-MS 联用可以对细胞水平的极微量多糖进行精确分析。需要说明的是,CE 法分析结果的重现性较差,在进样方法和定量分析方面需要在技术上进一步提高。
9 生物学方法 生物学方法主要是酶学方法,即利用各种特异性糖苷酶水解多糖分子得到寡糖片段,再与其他定性、定量方法联用推测多糖的结构。目前,较为先进的酶学方法是试剂阵列分析方法(RAAM) ,由Edge 等创立。它是利用一系列特定的外切糖苷酶的混合物对多糖或寡糖进行酶解,将酶解所得的片段分离,并通过其流体力学体积与计算机数据库中的数据进行比较,从而大大提高了多糖结构分析速度和精度。另外,还有一种类似固相蛋白测序的技术,它首先将多糖或寡糖固定在一个固定载体上,再依次用糖苷酶作用,对每一种外切酶酶解下来的单糖进行定性、定量分析。