欢迎做多糖的分离纯化结构鉴定的战友们及关心糖化学的战友们参与讨论!
2.2.3 核磁共振法
运用核磁共振技术可以在有或没有结构背景知识的情况下获得碳水化合物最完全的结构信息，它突破了用化学方法测定多糖结构的局限性，为复杂的多糖结构解析提供了有利工具。通过综合考虑一维、二维图谱，互相验证，得到更为准确的多糖结构信息。核磁共振波谱的多糖结构分析方法介绍如下。
2.2.3.1 糖残基数的确定
多糖是由单糖以一定的连接方式组成的重复结构单元，由一种或多种单糖组成，所以确定多糖的糖残基数是很重要的。一般来说，糖残基数是根据多糖的异头氢和异头碳来确定的。在1H NMR谱中，异头氢的化学位移在4.3～5.9之间；在13C NMR谱中，异头碳的化学位移一般在 90～112之间。根据出现的信号峰来确定多糖的糖残基数。但是在1H NMR谱中，异头氢区域的信号不一定都是异头氢的信号，比如在O-乙酰基取代碳上的氢，虽然不是异头氢，但是其氢的化学位移会因为O-乙酰基取代而向低场移动到4.3～5.9的异头氢区域，造成假象。所以对于在1H NMR谱和13C NMR谱中信号峰数目不一样时，还要通过1H-1H COSY谱和1H-13C COSY谱进行验证，进而确定多糖中的糖残基数。
2.2.3.2 单糖构型的确定
组成多糖的单糖一般可以分为呋喃糖构型和吡喃糖构型。在1H NMR谱中，呋喃糖构型的异头氢的化学位移在5.4左右，J1,2小于2Hz,此是呋喃糖构型区别于吡喃糖构型的主要特征。在 13C NMR谱中，异头碳的化学位移在103～112,并且呋喃糖糖醛糖的C4和呋喃糖糖酮糖的C5在82～84之间有信号，也是区别呋喃糖构型和吡喃糖构型的主要依据 ，。吡喃糖构型大致又包括葡萄糖构型（葡萄糖和异鼠李糖）、甘露糖构型（甘露糖和鼠李糖）和半乳糖构型（半乳糖、岩藻糖）。葡萄糖构型可以通过J2,3,J3,4,J4,5在8～10Hz之间来判断，还可以通过H2的高场化学位移的特征来判断。或者是在TOCSY谱中，具有一个H1～H6完全的自旋系统，也可以视为葡萄糖构型。甘露糖构型可以通过J1，2(0～2.0 Hz)非常小和J4,5(8～10 Hz)大的偶合常数来确定甘露糖构型。由于J3,4和J4,5较小（J3,4和J4,5<3 Hz）,阻碍了从H1→H6的相关传递，由此可以推断半乳糖构型的存在，同时H4相对于其他单糖残基而位于低场区域也可作为判断半乳糖构型的依据。在TOCSY谱中只能推出H1→H4和在NOESY谱中的H4与H3和H5有强的NOE效应也是半乳糖构型的主要特征。
2.2.3.3 单糖组分化学位移的确定
一般来说，可以通过1H NMR谱、1H-1H COSY谱和TOCSY（HOHAHA）谱推出单糖上各碳上氢的化学位移，然后根据13C NMR谱和1H-13C COSY谱（HMQC谱和HSQC谱）推出碳的化学位移。但是对于不同构型的还略微不同，比如半乳糖构型，因J3,4和J4,5较小，阻碍了交叉峰的出现，可以从1H-1H COSY谱中的交叉峰推出H1，H2和H3。由于H3和H4在1H-1H COSY谱中的J3,4较小，所以没有交叉峰的出现，因此 H4可以通过TOCSY（或HOHAHA）谱得出，根据H1的相关交叉峰进行判断；H5可由NOESY谱得出，由于H3和H4与H5信号相关。H6可以通过1H-1H COSY谱和TOCSY（或HOHAHA）谱得出，由于H5和H6在此谱上有交叉峰。H5和H6与H1和H4是否在同一糖环中，还可以通过HMBC谱，H1和C5相关、H5和C4相关、H6和C5相关来证明H5、H6是同一糖残基上的氢。碳的化学位移可由HMQC谱来推断，对于未被推出的，可用HMQC-TOCSY谱进行辅助，例如：H1与C1、C2、C3和C4相关，C5与H5、H6a和H6b相关，还可以通过HMBC谱进行验证，如：H1与C3、C5，H2与C1，H4与C5和C6相关等。而甘露糖构型由于J1,2较小，所以常采用DQF-COSY谱和TOCSY谱结合来确定H的化学位移。
2.2.3.4 异头构型的判断
对于呋喃糖构型来说，由于J1,2小于2Hz，其α或β构型不能用J1,2来判断，故也不能用JC1,H1进行判断,但可以通过C1的化学位移来判断。例如，Ribf的构型可以通过已知的α-D-Ribf1Me的C1的化学位移为103.1，β-D-Ribf1Me的化学位移为108.0来确定Rib为α或β构型。对于吡喃糖来说，在1H NMR中，吡喃糖构型的α构型通常在4.9～5.3之间,JH1,H2在0～3Hz之间；β构型通常在4.4～4.8之间，J H1,H2在6～8Hz之间，双峰。但是甘露糖构型不能用此方法来判断。由于J1，2非常小，不能用J1,2间的偶合常数来确定甘露糖的α或β构型,需通过该单糖残基上的H5和C5的化学位移与已知单糖的H5和C5的化学位移来判断：一般来说，α-甘露糖构型比β-甘露糖构型的H5的化学位移与已知对照向低场移动0.4ppm左右,而C5的化学位移却向高场移动了4ppm左右。吡喃糖构型还可以通过HMQC谱，吡喃糖构型的α构型的JC1,H1在170Hz左右；β构型的JC1,H1在160Hz左右 。同时吡喃糖构型还可以通过NOESY谱或ROESY谱来进行验证。例如吡喃构型的单糖残基中若H1和H2出现交叉峰则为α构型，若H1和H3、H1和H5之间出现交叉峰则为β构型。在HMBC中，H1与C3和C5出现交叉峰，则被视为α构型。
2.2.3.5 连接位置和顺序
多糖中的单糖之间的连接位置可以通过苷化位移来判断。苷化位移在13C NMR谱中比1HNMR谱有规律些，所以通常根据13C NMR谱的化学位移来判断单糖之间的连接位置。一般来说，苷化的碳会向低场位移4～10,而邻位碳通常向高场有较小的位移0.9～4.6，但不一定是相同的值。单糖之间的顺序的确定可以通过NOESY谱或ROESY谱进行判断,同时还可以通过HMBC谱进行验证。
2.2.3.6 取代基的位置
在13C NMR中，N-乙酰基（N-AC）的甲基碳信号在22～23.5之间， N取代基上的碳在52～58之间,N-AC的羰基信号在170～180之间；在1H NMR中，N-AC的甲基上的氢的信号为2.0～2.2之间。N-AC取代基可以通过HMBC谱来确定其在糖残基上的位置，糖环上N-AC取代基的碳上的氢和N-AC上的羰基有相关信号，并且此羰基信号同时和N-AC基的甲基信号发生偶合。在13C NMR中，O-乙酰基(O-AC)的甲基碳信号在18～22之间, O-AC的上羰基信号在170～180之间； 在1H NMR中，O-AC的甲基上的氢信号为1.8～2.2之间。O-AC取代基会使其取代碳的化学位移向高场移动。在1H NMR谱中甲基信号碳上的氢的化学位移在1.1～1.3之间，在13C NMR中甲基信号碳的化学位移为16～18ppm。MeO信号在1H NMR中为3.3～3.5之间，在13C NMR中为55～61之间。磷酸基团可以根据31P NMR谱中δ1.9处有信号峰来证实。
摘自本人发表的<食（药）用菌多糖的提取、分离纯化与结构分析>文章部分内容
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2.2.3 核磁共振法
运用核磁共振技术可以在有或没有结构背景知识的情况下获得碳水化合物最完全的结构信息，它突破了用化学方法测定多糖结构的局限性，为复杂的多糖结构解析提供了有利工具。通过综合考虑一维、二维图谱，互相验证，得到更为准确的多糖结构信息。核磁共振波谱的多糖结构分析方法介绍如下。
2.2.3.1 糖残基数的确定
多糖是由单糖以一定的连接方式组成的重复结构单元，由一种或多种单糖组成，所以确定多糖的糖残基数是很重要的。一般来说，糖残基数是根据多糖的异头氢和异头碳来确定的。在1H NMR谱中，异头氢的化学位移在4.3～5.9之间；在13C NMR谱中，异头碳的化学位移一般在 90～112之间。根据出现的信号峰来确定多糖的糖残基数。但是在1H NMR谱中，异头氢区域的信号不一定都是异头氢的信号，比如在O-乙酰基取代碳上的氢，虽然不是异头氢，但是其氢的化学位移会因为O-乙酰基取代而向低场移动到4.3～5.9的异头氢区域，造成假象。所以对于在1H NMR谱和13C NMR谱中信号峰数目不一样时，还要通过1H-1H COSY谱和1H-13C COSY谱进行验证，进而确定多糖中的糖残基数。
2.2.3.2 单糖构型的确定
组成多糖的单糖一般可以分为呋喃糖构型和吡喃糖构型。在1H NMR谱中，呋喃糖构型的异头氢的化学位移在5.4左右，J1,2小于2Hz,此是呋喃糖构型区别于吡喃糖构型的主要特征。在 13C NMR谱中，异头碳的化学位移在103～112,并且呋喃糖糖醛糖的C4和呋喃糖糖酮糖的C5在82～84之间有信号，也是区别呋喃糖构型和吡喃糖构型的主要依据 ，。吡喃糖构型大致又包括葡萄糖构型（葡萄糖和异鼠李糖）、甘露糖构型（甘露糖和鼠李糖）和半乳糖构型（半乳糖、岩藻糖）。葡萄糖构型可以通过J2,3,J3,4,J4,5在8～10Hz之间来判断，还可以通过H2的高场化学位移的特征来判断。或者是在TOCSY谱中，具有一个H1～H6完全的自旋系统，也可以视为葡萄糖构型。甘露糖构型可以通过J1，2(0～2.0 Hz)非常小和J4,5(8～10 Hz)大的偶合常数来确定甘露糖构型。由于J3,4和J4,5较小（J3,4和J4,5<3 Hz）,阻碍了从H1→H6的相关传递，由此可以推断半乳糖构型的存在，同时H4相对于其他单糖残基而位于低场区域也可作为判断半乳糖构型的依据。在TOCSY谱中只能推出H1→H4和在NOESY谱中的H4与H3和H5有强的NOE效应也是半乳糖构型的主要特征。
2.2.3.3 单糖组分化学位移的确定
一般来说，可以通过1H NMR谱、1H-1H COSY谱和TOCSY（HOHAHA）谱推出单糖上各碳上氢的化学位移，然后根据13C NMR谱和1H-13C COSY谱（HMQC谱和HSQC谱）推出碳的化学位移。但是对于不同构型的还略微不同，比如半乳糖构型，因J3,4和J4,5较小，阻碍了交叉峰的出现，可以从1H-1H COSY谱中的交叉峰推出H1，H2和H3。由于H3和H4在1H-1H COSY谱中的J3,4较小，所以没有交叉峰的出现，因此 H4可以通过TOCSY（或HOHAHA）谱得出，根据H1的相关交叉峰进行判断；H5可由NOESY谱得出，由于H3和H4与H5信号相关。H6可以通过1H-1H COSY谱和TOCSY（或HOHAHA）谱得出，由于H5和H6在此谱上有交叉峰。H5和H6与H1和H4是否在同一糖环中，还可以通过HMBC谱，H1和C5相关、H5和C4相关、H6和C5相关来证明H5、H6是同一糖残基上的氢。碳的化学位移可由HMQC谱来推断，对于未被推出的，可用HMQC-TOCSY谱进行辅助，例如：H1与C1、C2、C3和C4相关，C5与H5、H6a和H6b相关，还可以通过HMBC谱进行验证，如：H1与C3、C5，H2与C1，H4与C5和C6相关等。而甘露糖构型由于J1,2较小，所以常采用DQF-COSY谱和TOCSY谱结合来确定H的化学位移。
2.2.3.4 异头构型的判断
对于呋喃糖构型来说，由于J1,2小于2Hz，其α或β构型不能用J1,2来判断，故也不能用JC1,H1进行判断,但可以通过C1的化学位移来判断。例如，Ribf的构型可以通过已知的α-D-Ribf1Me的C1的化学位移为103.1，β-D-Ribf1Me的化学位移为108.0来确定Rib为α或β构型。对于吡喃糖来说，在1H NMR中，吡喃糖构型的α构型通常在4.9～5.3之间,JH1,H2在0～3Hz之间；β构型通常在4.4～4.8之间，J H1,H2在6～8Hz之间，双峰。但是甘露糖构型不能用此方法来判断。由于J1，2非常小，不能用J1,2间的偶合常数来确定甘露糖的α或β构型,需通过该单糖残基上的H5和C5的化学位移与已知单糖的H5和C5的化学位移来判断：一般来说，α-甘露糖构型比β-甘露糖构型的H5的化学位移与已知对照向低场移动0.4ppm左右,而C5的化学位移却向高场移动了4ppm左右。吡喃糖构型还可以通过HMQC谱，吡喃糖构型的α构型的JC1,H1在170Hz左右；β构型的JC1,H1在160Hz左右 。同时吡喃糖构型还可以通过NOESY谱或ROESY谱来进行验证。例如吡喃构型的单糖残基中若H1和H2出现交叉峰则为α构型，若H1和H3、H1和H5之间出现交叉峰则为β构型。在HMBC中，H1与C3和C5出现交叉峰，则被视为α构型。
2.2.3.5 连接位置和顺序
多糖中的单糖之间的连接位置可以通过苷化位移来判断。苷化位移在13C NMR谱中比1HNMR谱有规律些，所以通常根据13C NMR谱的化学位移来判断单糖之间的连接位置。一般来说，苷化的碳会向低场位移4～10,而邻位碳通常向高场有较小的位移0.9～4.6，但不一定是相同的值。单糖之间的顺序的确定可以通过NOESY谱或ROESY谱进行判断,同时还可以通过HMBC谱进行验证。
2.2.3.6 取代基的位置
在13C NMR中，N-乙酰基（N-AC）的甲基碳信号在22～23.5之间， N取代基上的碳在52～58之间,N-AC的羰基信号在170～180之间；在1H NMR中，N-AC的甲基上的氢的信号为2.0～2.2之间。N-AC取代基可以通过HMBC谱来确定其在糖残基上的位置，糖环上N-AC取代基的碳上的氢和N-AC上的羰基有相关信号，并且此羰基信号同时和N-AC基的甲基信号发生偶合。在13C NMR中，O-乙酰基(O-AC)的甲基碳信号在18～22之间, O-AC的上羰基信号在170～180之间； 在1H NMR中，O-AC的甲基上的氢信号为1.8～2.2之间。O-AC取代基会使其取代碳的化学位移向高场移动。在1H NMR谱中甲基信号碳上的氢的化学位移在1.1～1.3之间，在13C NMR中甲基信号碳的化学位移为16～18ppm。MeO信号在1H NMR中为3.3～3.5之间，在13C NMR中为55～61之间。磷酸基团可以根据31P NMR谱中δ1.9处有信号峰来证实。
摘自本人发表的<食（药）用菌多糖的提取、分离纯化与结构分析>文章部分内容
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